DNA methylation analysis for minimal-invasive Breast cancer diagnostic testing

Veranderungen im Methylierungsmuster der DNA geschehen fruh in der Entwicklung von Tumoren. Zumeist sind Promoter-Regionen von Tumorsupressor-Genen und Onko-Genen betroffen, die einen Wachstumsvorteil der Krebszellen zur Folge haben. In dieser Studie wurde die Moglichkeit der Detektion dieser epigenetischen Aberrationen in zellfreier DNA aus Serum von Brustkrebspatienten untersucht, da diese potenzielle Biomarker zur minimal-invasiven Diagnostik darstellen. Hierzu wurden unterschiedliche DNA–Isolationsverfahren und Amplifikationsmethoden zur Anreicherung methylierter DNA getestet. Mit den optimierten Methoden wurde Serum-DNA von Brustkrebspatienten mit A) malignen Neoplasmen (n=40), B) nicht invasiv wachsenden Tumoren (n=18) und C) gesunden Kontrollprobandinnen (n=24) isoliert. Der DNA Gehalt im Serum von Brustkrebspatienten mit metastasierenden Tumoren [45,64ng/ml ± 32,31ng] war gegenuber gesunden Probanden [10,58ng/ml ± 9,71ng] signifikant erhoht (p = 0,0013; Wilcoxon-Rangsummentest). Die methylierte DNA Fraktion der Proben wurde mit einem Restriktionsenzymen – basierten Verfahren und einer „Rolling Circle Amplifikation“ (RCA) genomweit angereichert. Nach erfolgreicher Prozessierung von 72 der 82 DNA Proben konnte ein Biomarker-Screening zur Unterscheidung der Patientengruppen durchgefuhrt werden. Dazu wurden 360 ausgewahlte DNA Bereiche in Multiplex-PCR Reaktionen amplifiziert und die PCR-Produkte durch Hybridisierung auf einem „targeted-micro-array“ detektiert. Die Micro-Array Analyse erlaubte eine Unterscheidung zwischen den Brustkrebspatienten und den Normal Kontrollen, wobei jedoch nach kritischer Betrachtung ein experimenteller Bias welcher zu diesen Unterschieden beitragt nicht ausgeschlossen werden kann. In dieser Arbeit konnte somit ein Protokoll erarbeitet werden, das ein genomweites Biomarker-Screening zur Auffindung von DNA-Methylierungsmarkern fur die minimal invasive Diagnostik aus geringsten Mengen zellfreier Serum DNA ermoglicht.