Studium interakce proteinů rodiny p53 s DNA modifikovanou reaktivními skupinami pro kovalentní biokonjugace

V teto praci jsme se zabývali připravou specificky modifikovaných DNA pro nasledne biokonjugace s DNA-vazebnými proteiny rodiny p53. Pomoci enzymaticke inkorporace (PEX) s využitim 2´-deoxycytidin trifosfatu s konjugovaným propargylvinylsulfonamidem (PVS) byly připraveny znacene DNA substraty, ktere obsahovaly cileně PVS-modifikovanou p53-vazebnou sekvenci. Radioaktivně znacene DNA substraty byly inkubovany s proteiny p53, p63 a p73 (exprimovane jako GST-fuzni konstrukty s centralni vazebnou domenou) a pote analyzovany pomoci nekompeticni EMSA. Bylo prokazano, že za těchto podminek se testovane proteiny važou jak na specifickou, tak nespecifickou PVS-modifikovanou sekvenci. Vlastni konjugacni reakce byla provedena inkubaci reakcni směsi při laboratorni teplotě. Po nasledne mirne denaturaci byla reakcni směs analyzovana pomoci radioaktivni denaturacni PAGE (detekce 32P-znacene DNA), a pomoci imunodetekce s využitim specifických protilatek (detekce proteinů). Vznik kovalentnich konjugatů byl prokazan na urovni DNA u PVS-modifikovaných DNA substratů. Naproti tomu, vsak nebyl detekovan na urovni proteinu v připadě imunodetekce.