Inibidor de proteinase do tipo Bowman-Birk isolado de sementes de Clitoria fairchildiana (Fabaceae) : caracterização e atividade biológica sobre Anagasta kuehniella e Corcyra cephalonica

Os inibidores de proteinases extraidos de plantas tem se mostrado promissores como um metodo alternativo no combate aos insetos-pragas. Neste estudo, um inibidor de peptidase foi isolado de sementes de Clitoria fairchildiana (Papilionoideae), denominado CFPI, caracterizado funcional e estruturalmente e sua atividade inseticida foi avaliada. CFPI foi purificado por exclusao molecular, seguido por coluna de interacao hidrofobica e apresentou um pico majoritario com atividade inibitoria apos ter sido submetido a filtracao com alta resolucao. Estudos cineticos realizados com CFPI purificado mostraram uma atividade inibitoria do tipo competitiva contra tripsina e quimotripsina bovinas, com uma estequiometria de inibicao de 1:1 para ambas as enzimas. A constante de inibicao de CFPI contra tripsina e quimotripsina bovinas foram 3,3 x 10-10 e 1,5 x 10-10 M, respectivamente, revelando uma forte capacidade de ligacao. Eletroforese em SDS-Page mostrou que CFPI possui uma unica cadeia polipeptidica, com uma massa molecular aparente de 15 kDa, sob condicoes nao redutoras. Entretanto, o inibidor apresentou uma massa acurada de 7973 Daltons determinada por MALDI-TOF, sugerindo que CFPI forme dimeros em solucao. Essa caracteristica, aliada a estequiometria de inibicao para tripsina e quimotripsina, a constante de inibicao (Ki) para ambas as enzimas e ao sequenciamento e alinhamento N-terminal, permitiram classificar CFPI como membro da familia Bowman-Birk de inibidores. O inibidor manteve-se estavel ao aquecimento progressivo por 30 min a cada temperatura, variando de 37 ate 100 ?C e a analise de dicroismo nao mostrou mudancas no espectro a 207 nm apos aquecimento a 90 ?C e subsequente resfriamento. Alem disso, CFPI mostrou atividade sobre uma ampla faixa de pH (2-10). Em contraste, a reducao de CFPI com DTT resultou em perda de atividade inibitoria contra tripsina e quimotripsina. CFPI exibiu atividade inibitoria consideravel contra enzimas tripsinas de Anagasta kuehniella (76%), Diatraea saccharalis (59%) e Heliothis virescens (49%). Suas propriedades inseticidas foram confirmadas a partir do impacto negativo causado no crescimento de A. kuehniella e C. cephalonica. O inibidor exerceu efeito antinutricional sobre A. kuehniella tanto na geracao F0 como em F1. Abstract