人线粒体tRNA^Leu（UUR）及其突变体的基因克隆,表达和纯化

将化学法合成的人线粒体ｔＲＮＡ＾Ｌｅｕ（ＵＵＲ）及其突变体（ｔＲＮＡ）＾Ｌｅｕ（Ｍ）基因分别连接到载体ｐＧＥＭ－９ｚｆ（－）中，并转化到大肠杆菌ＪＭ１０９中得到两个转化体分别为Ｌｅｕ－Ｗ和Ｌｅｕ－Ｍ。在ＩＰＴＧ的诱导下，ｔＲＮＡ＾Ｌｅｕ（ＵＵＲ）和ｔＲＮＡ＾Ｌｅｕ（Ｍ）的表达量可达总小分子ＲＮＡ的１９．１０％和１７．７６％。经ＤＥＡＥ－ｓｅｐｈｅｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ柱层析可使它们的纯度提高３倍。最后用１５％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，并用大肠杆菌亮氨酰ｔＲＮＡ合成酶（ＬｅｕＲＳ）分别测定了它们的氨酰化反应动力学常数。结果显示，ｍｔＲＮＡ＾Ｌｅｕ（Ｍ）的Ｋｃａｔ／Ｋｍ值约为ｍｔＲＮＡ＾Ｌｅｕ（ＵＵＲ）的１／５，提示该突变可使ｍｔＲＮＡ＾Ｌｅｕ（ＵＵＲ）的氨基酸接受能力明显下降。