人线粒体tRNA^Leu(UUR)及其突变体的基因克隆,表达和纯化
2000
将化学法合成的人线粒体tRNA^Leu(UUR)及其突变体(tRNA)^Leu(M)基因分别连接到载体pGEM-9zf(-)中,并转化到大肠杆菌JM109中得到两个转化体分别为Leu-W和Leu-M。在IPTG的诱导下,tRNA^Leu(UUR)和tRNA^Leu(M)的表达量可达总小分子RNA的19.10%和17.76%。经DEAE-sepherose CL4B柱层析可使它们的纯度提高3倍。最后用15%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,并用大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶(LeuRS)分别测定了它们的氨酰化反应动力学常数。结果显示,mtRNA^Leu(M)的Kcat/Km值约为mtRNA^Leu(UUR)的1/5,提示该突变可使mtRNA^Leu(UUR)的氨基酸接受能力明显下降。
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