Étude par RMN de la créatine kinase musculaire et d’un nouveau domaine de liaison à l’ubiquitine dans la protéine STAM2 : NMR study of the creatine kinase muscle and a new binding domain in the protein ubiquitin STAM 2

Au cours de cette these, nous avons etudie deux proteines par RMN : la creatine kinase musculaire (CK-MM) et le domaine UIM-SH3 de la proteine STAM2, seuls ou en interaction avec leurs partenaires. La CK-MM est une enzyme active sous forme dimerique. Elle appartient a la famille des guanidino-kinases et intervient dans le processus energetique de la cellule. Le but de l’etude etait d’elucider le mode de fonctionnement de la CK-MM. Pour cela, nous avons enregistre des experiences de relaxation R1, R2 et des experiences de perturbation de deplacement chimique sur la CK-MM libre et complexee avec MgADP et sous forme TSAC. Ces experiences montrent que la boucle 320s, specifique a la reconnaissance des substrats, possede une dynamique rapide en absence de substrats et une dynamique ralentie en presence de substrats. La fixation des substrats dans les sites actifs de la CK-MM induit des modifications conformationelles importantes. La proteine STAM2 est composee de deux UBDs : VHS, et UIM et d’un domaine SH3 connu pour interagir avec des deubiquitinases UBPY et AMSH. Cette proteine est impliquee dans la voie de degradation lysosomale. L’objectif de cette etude est la caracterisation du complexe SH3/ubiquitine. Pour cela, nous avons enregistre des experiences de perturbation de deplacement chimique et de relaxation R1, R2 et nOes sur le complexe UIM-SH3/ubiquitine. Ces experiences mettent en evidence que les domaines UIM et SH3 sont capables d’interagir chacun avec une ubiquitine, avec une affinite de l’ordre de la centaine de micromolaire. L’interface entre les UBDs et l’ubiquitine implique majoritairement des residus hydrophobes et conserves%%%%In this thesis, we study two proteins by NMR: the muscular creatine kinase (CK-MM) and the SH3 domain of STAM2 protein, in the free and complexed forms. CK-MM is an active homodimeric enzyme which belongs to the guanidino-phosphagen-kinase family. This enzyme is involved in energetic process in the cell. The aim of this study is to elucidate the functional mode of the CK-MM. For this purpose, we measured R1 and R2 relaxation rates and chemical shit perturbation experiments on the substrate-free CK-MM, the CK-MM/MgADP complex, and the inhibitory ternary complex CK-MM/MgADP-creatine-nitrate. The experiments show that the loop 320s, specific recognition of the substrates, possesses a fast dynamic in absence of substrates (in the order of nano-picosecond) and a slower dynamic in presence of creatine-MgADP-nitrate ion. The binding of the substrate in the two active sites induces of significant conformational modification of the CK-MM. STAM2 protein consists in two ubiquitin binding domains (VHS and UIM) and a SH3 domain which interacts with deubiquinating enzymes AMSH and UBPY. This protein is involved in the lysosomal degradation pathway. The aim of this study is the characterization of the interaction between SH3 domain of STAM2 and ubiquitin. For this, we recorded the R1, R2, nOes relaxation experiments and chemical shift perturbation experiments on the UIM-SH3/ubiquitin complex.…