Investigations biochimiques et moléculaires des déficits en pyruvate déshydrogénase et étude d'une mutation intronique impliquant le facteur d'épissage SC35

Les deficits en pyruvate desydrogenase (PDH) constituent une des premieres causes d'hyperlactatemie primaire chez les enfants atteints de maladies neurologiques mitochondriales. Un blocage de cette enzyme entraine une elevation parallele de la lactatemie et de la pyruvicemie (et du lactate et pyruvate dans le liquide cephalo-rachidien), avec un rapport lactate/pyruvate normal. Ces dosages simples sont le point de depart biologique de la recherche de deficit en PDH pour tous les patients et la majorite des patientes. Nous presentons dans la premiere partie de ce travail les resultats obtenus au laboratoire pour une cohorte de 30 patients. Dix-huit d'entre eux presentaient un anomalie au niveau du gene PDHA1(Xp22. 1-Xp22. 2), quatre au niveau du gene PDHX (11p13). Pour un patient, nous avons diagnostique un deficit en E3 (7p31. 1-7q32), sous-unite commune a trois deshydrogenases mitochondriales dont la PDH. Pour sept patients, nous n'avons pas identifie d'anomalie moleculaire malgre des signes clinico-biologiques tres evocateurs. Ces donnees sont discutees et comparees a celles de la litterature. Une proposition de conduite a tenir pour le diagnostic, en fonction des nouveaux outils d'analyse enzymatique et moleculaire que nous avons developpes. Sera developpee a la fin du document. Dans la seconde partie, nous detaillons les investigations moleculaires plus approfondies des deficits en PDH. Nous presentons la mise en place d'outils preliminaires qui permettront l'etude de la fonctionnalite des nouvelles mutations faux-sens chez S. Cerevisiae. Nous revenons en detail sur la detection de deux deletions intrageniques (sur les genes PDHA1 et PDH X), sur l'etude d'un mosaicisme somatique chez un garcon presentant une mutation au niveau du gene PDHA1 et sur deux mutations entrainant une degradation de l'ARNm par le mecanisme de "Nonsense mRNA mediated Decay" (genes PDHA1 et E3BP). Nous terminons par un recapitulatif des anomalies d'epissage. Dans la derniere partie, nous etudions le mecanisme moleculaire d'une mutation ponctuelle intronique sur la sequence du gene PGHA1, conduisant a une retention partielle d'un intron au niveau de l'ARNm. Nous montrons par epissage in vitro que cette mutation intronique (IVS7+26G>A)entraine l'utilisation d'un site cryptique d'epissage, "GT" en position 46 et 47 de l'intron 7. Ainsi que l'avait predit le programme "ESE finder", nous montrons par UV-crosslinking que la proteine SC35, facteur d'epissage de la famille des proteines SR, se fixe avec une plus grande affinite sur la sequence intronique mutee G>A (ESE), entrainant ainsi une utilisation preferentielle du site donneur cryptique. Nous montrons enfin, qu'une depletion en SC35 (obtenue par l'utilisation de SiRNA) sur les fibroblastes du patient entraine une disparition de l'ARNm anormalement episse. Ce travail demontre l'implication de l'interaction SC35/ESE et le role des sequences introniques en pathologie humaine. De plus, il ouvre de nombreuses voies de recherche au niveau de la therapie des anomalies d'epissage.