Modulation of TRPV1 function by phosphorylation and site-directed mutagenesis: from structure to biophysics

Der TRPV1 Rezeptor ist ein polymodal aktivierbarer Kationenkanal, der eine besondere Rolle in der Nozizeption einnimmt. Es ist bekannt, dass die positive Modulation der TRPV1 Funktion durch Proteinkinase-vermittelte Phosphorylierungsprozesse zur Ausbildung von Hyperalgesie und/oder Allodynie beitragt. Die vorliegende Studie hat das Ziel, die funktionellen Auswirkungen der Cdk5-vermittelten Phosphorylierung des TRPV1 Rezeptors an Position Threonin-406 aufzuklaren. Mit Hilfe von elektrophysiologischen Messungen konnten wir zeigen, dass die Koexpression von TRPV1 und Cdk5 in CHO Zellen eine Ca2+-abhangige Desensitisierung des TRPV1 Ionenkanals verhindert. Um den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion der TRPV1 Phosphorylierung durch die Cdk5 zu untersuchen, haben wir verschiedene TRPV1T406 Mutanten erstellt, welche durch Einfugen negativ geladener Aminosaurereste die Cdk5-abhangige Phosphorylierung am Threonin-406 imitieren, oder diese durch Ersetzen des Threoninrests mit Alanin inhibieren. Mit Hilfe elektrophysiologischer Ganz-Zell und Einzelkanal Messungen, sowie mit Ca2+-imaging und TIRF Mikroskopie, haben wir die Funktion dieser TRPV1T406 Mutanten durch ihre Reaktion auf verschiedene Stimuli, wie Capsaicin, Hitze oder Protonen umfassend charakterisiert. Die Funktionsanalyse ergab, dass die Modifikation an Position T406 weitreichende Folgen fur die Funktion des TRPV1 Ionenkanals haben kann. Das einbringen einer negativ geladenen Aminosaure, wie z.B. Asparaginsaure, veranderte die Ligandensensitivitat, die Aktivierungs- und Desensitisierungskinetik sowie die Spannungsabhangigkeit des TRPV1 Ionenkanals. Die Einzelkanal Eigenschaften von TRPV1T406D Ionenkanalen zeigten ebenfalls deutliche Veranderungen, die auf einen veranderten Gating-Mechanismus des Rezeptors hindeuten. Unter Berucksichtigung der publizierten hochaufgelosten 3D Struktur des TRPV1 haben wir einen moglichen (mechanistischen) Ubertragungsweg unter Beteiligung der Position 406 identifiziert und diesen Weg durch gezieltes Einbringen von Alanin-Resten und elektrophysiologischer Charakterisierung der TRPV1 Mutationen uberpruft. Eine Storung des Ubertragungsweges fuhrte ebenfalls zu einer veranderten Funktion des TRPV1 Ionenkanals. Die Ergebnisse zeigen, dass die Position T406 des TRPV1 eine funktionelle Schlusselrolle einnimmt und durch Phosphorylierung an der Modulation der Kanalfunktion beteiligt ist.