Genómica evolutiva en cicindélidos: caracterización y análisis de expresión de genes relacionados con la reproducción y el sistema inmune

Los cicindelidos o escarabajos tigre son una familia de coleopteros depredadores pertenecientes al suborden Adephaga que cuentan con mas de 2500 especies distribuidas por todo el mundo. Son especies importantes en los ecosistemas y comunmente usadas como bioindicadores que han despertado la curiosidad de cientificos y aficionados y han sido frecuentemente estudiados a distintos niveles. Sin embargo, hay poca informacion sobre los transcriptomas de los cicindelidos, y no se han realizado estudios para identificar y caracterizar los genes que podrian estar involucrados en el proceso evolutivo. El objetivo principal de esta tesis es identificar, caracterizar y analizar en un contexto evolutivo genes relacionados con la reproduccion y el sistema inmune en cicindelidos. Para ello se han analizado genotecas de EST de distintos escarabajos tigre (Calomera littoralis, Cephalota litorea y Cicindela campestris). En el primer capitulo se realizan analisis bioinformaticos y de expresion diferencial entre machos y hembras, identificandose cuatro posibles proteinas del fluido seminal (Acp01-Acp04). Se realiza tambien una busqueda de homologia mediante RT-PCR en otras especies de cicindelidos para inferir el tipo de evolucion de cada proteina. AcpC03 unicamente amplifico en C. littoralis y Lophyra flexuosa especies que guardan una estrecha relacion filogenetica y por tanto se trataria de una proteina de rapida evolucion. AcpC04 y Acp01 amplifican en todas las especies de cicindelidos analizadas, por lo que se trata de proteinas conservadas al menos en los escarabajos tigre. En el segundo capitulo se realizan analisis bioinformaticos para caracterizar en Cicindela campestris dos modificadores post traduccion, la enzima de conjugacion E2 SUMO (Cc-UBC9) y una proteina de fusion ubiquitina-ribosomica (Cc-UBS27). Los analisis de seleccion realizados tras la amplificacion de estos genes en siete especies de cicindelidos revelaron que ambos genes estan sometidos a seleccion purificadora, lo que pondria de manifiesto la importancia de la funcion de estas proteinas. Los analisis de expresion genica mediante RT-qPCR mostraron los mayores niveles de expresion en gonadas en comparacion con el resto de tejidos analizados para ambos genes, lo que indica que juegan un papel activo en la gametogenesis de los cicindelidos. Adicionalmente la mayor expresion de estos genes en testiculo inmaduro, en relacion al estadio maduro, indica que estos genes estan involucrados en mayor medida en las etapas tempranas de la gametogenesis. En el tercer capitulo se realizan analisis bioinformaticos para identificar una defensina en Calomera littoralis (Clit-Def). Los analisis estructurales y bioinformaticos sugirieren que Clit-Def tiene capacidad antimicrobiana y por tanto esta involucrada en el sistema inmune. Adicionalmente, los analisis de expresion de estos genes mediante RT-qPCR revelaron que Clit-Def en C. littoralis se sobre expresa en diferentes tejidos, principalmente en abdomen, tras la infeccion con lipopolisacaridos de Escherichia coli, lo que sugiere que este gen juega un papel importante en la respuesta humoral. El analisis filogenetico de la defensina de este trabajo junto con las de otros coleopteros obtenidas de GenBank mostro que las defensinas no se agrupan en clados congruentes con la taxonomia lo que indica que se trata de proteinas de alta diversidad. La descripcion de estos genes proporciona informacion relevante sobre la biologia de los cicindelidos, y tambien sirve de base para entender mejor su proceso de diversificacion, lo que conduce a una mayor comprension de sus relaciones filogeneticas y aporta indicios sobre los procesos de especiacion. Summary Cicindelids or tiger beetles are a family of predatory beetles belonging to the suborder Adephaga, which have more than 2500 species worldwide distributed. They are important in ecosystems and are species commonly used as bioindicators that have provoked the curiosity of scientists and amateurs, and therefore they have been deeply studied at different levels. Nevertheless, there is little information on the transcriptomes of tiger beetles, and no studies have been conducted to identify and characterise genes that could be involved in the evolutionary process. The objective of this thesis is to identify, characterise and analyse reproductive and immune related genes in cicindelids from an evolutionary perspective. To achieve this objective EST libraries from different tiger beetles (Calomera littoralis, Cephalota litorea and Cicindela campestris) has been analysed. In the first chapter bioinformatic analyses and differential expression analyses between males and females are performed, identifying four putative seminal fluid proteins (Acp01-Acp04). Homology searches in other tiger beetle species, using RT-PCR, have been performed to infer the evolution of these proteins. AcpC03 only amplified in C. littoralis and Lophyra flexuosa, species that are phylogenetically closely related and thus, it is consider a rapidly evolving protein. Acp01 and AcpC04 amplified in all cicindelid species analysed so they seem most likely to be conserved proteins at least in one group of tiger beetles. In the second chapter, bioinformatic analysis was performed to characterise two post-translation modifiers, the SUMO conjugating enzyme E2 (Cc-UBC9) and a ubiquitin-ribosomal fusion protein (Cc-UBS27) in Cicindela campestris. Selection analyses, performed after amplification of these genes in seven species of tiger beetles, revealed that both genes are under purifying selection what highlights the importance of these proteins. The gene expression analysis by RT-qPCR showed for both genes the highest levels of expression in gonads compared with other tissues analysed, indicating that they play an active role in gametogenesis in cicindelids. Additionally, the higher expression of these genes in immature testis relative to mature stages, indicates that these genes are mostly involved in the early stages of gametogenesis. In the third chapter, bioinformatic analyses are performed to identify a defensin gene in Calomera littoralis (Clit-Def). Structural and bioinformatic analyses suggested that Clit-Def has antimicrobial activity and therefore is involved in the immune system. Additionally, expression analysis of these genes via RT-qPCR, revealed that Clit-Def is overexpressed in C. littoralis, after infection with Escherichia coli lipopolysaccharides, in different tissues and mainly in the abdomen, suggesting that this gene plays a role in the humoral response. Phylogenetic analysis using the defensin characterised in this work (Clit-Def) together with other coleopteran defensins obtained from GenBank, showed that they are not grouped into clades congruent with the taxonomy, indicating that defensins are highly diverse proteins. The description of these genes provides important information on the tiger beetles biology, and also provides a foundation to better understand their diversification process, leading to a better comprehension of their phylogenetic relationships and providing clues on speciation processes.