Desenvolvimento da técnica de RT-nPCR para a detecção do Vírus da Diarreia Viral Bovina.

O virus da diarreia viral bovina (BVDV, bovine viral diarrhea virus ) e o agente etiologico de patologias sistemicas em bovinos que sao responsaveis por importantes perdas economicas na pecuaria mundial. Dados epidemiologicos demonstram que o BVDV esta presente nos rebanhos do nosso estado com uma prevalencia de animais portadores de anticorpos entre 23,4 e 58,8%. Taxonomicamente o BVDV pertence a familia Flaviviridae , genero Pestivirus e pode ser classificado em 3 genotipos: BVDV-1, BVDV-2 e BVDV-3. A particula viral e envelopada, possui simetria icosaedrica e o material genetico e constituido de uma unica fita de RNA com orientacao positiva. O diagnostico da diarreia viral bovina e geralmente realizado com base na presenca de achados clinicos e patologicos caracteristicos, mas a suspeita clinica deve ser confirmada com analises laboratoriais de isolamento e/ou deteccao do RNA viral. Recentemente, a deteccao molecular pela tecnica de transcricao reversa – reacao em cadeia da polimerase (RT-PCR) tem sido mais utilizada devido a rapidez e maior facilidade de realizacao em uma rotina de analise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma tecnica com duas etapas de amplificacao (RT-nPCR) para aumentar a sensibilidade e especificidade na deteccao do BVDV em relacao a tecnica de RT-PCR tradicional. A metodologia consistiu em duas etapas: (1) desenho da tecnica de amplificacao e (2) validacao do procedimento analitico completo. No desenho da tecnica foram selecionados 4 iniciadores ( primers ) localizados na regiao 5´ nao traduzida e gene N-pro, correspondente a porcao inicial do genoma do BVDV, com base na pesquisa em artigos cientificos (Vilcek S, 1994;39(11):687-700; Givens et al Vet. Microbiol. 96, 145-155). A tecnica de amplificacao foi estabelecida com uma primeira amplificacao utilizando o par de primers externos BVD100F / BVD326R e a segunda amplificacao com o par de primers internos BVDV324F / HCV 368, resultando em um fragmento de 282 bp.  O procedimento foi entao implementado no laboratorio, sendo realizadas analises de uma cultura viral e de amostras clinicas animais (soro de touros de gado de corte). A avaliacao de cultura pura e diluicoes destas possibilitou verificar deteccao ate diluicao de 10 -5 , apresentando uma sensibilidade analitica 10 vezes superior do que a RT-PCR (deteccao ate diluicao de 10 -4 ). A deteccao do virus em 78 pools de 5 amostras (obtidos a partir de 390 amostras de soro de touros de diferentes estabelecimentos agropecuarios) demonstraram a deteccao do BVDV em 16 pools previamente negativos pela tecnica de RT-PCR. Com base nesses dados concluimos que a tecnica RT-nPCR mostrou-se mais sensivel do que a RT-PCR na deteccao do virus. Novos estudos estao sendo realizados para uma avaliacao mais detalhada do desempenho analitico do procedimento.