Nanovesículas de tamaño controlado para aplicaciones biotecnológicas y bioanalíticas

Las nanovesiculas, un tipo particular de coloides organicos, esta generando un interes creciente en el ambito de la biotecnologia, y particularmente en el campo del bioanalisis. La versatilidad de sus caracteristicas morfologicas y funcionales hace de ellas un biomaterial muy interesante para vehiculo de liberacion de farmacos, marca de inmunoensayos, o como sistema biomietico de membranas o vesiculas extracelulares. Sin embargo, estas nuevas aplicaciones imponen una serie de requisitos sobre los metodos de preparacion que suponen un reto tecnologico y han generado un campo de investigacion muy activo. El control sobre el tamano de particula y su monodispersidad son caracteristicas esenciales que se deben controlar mediante la mejora de los metodos actuales y la propuesta de nuevas tecnologias disenadas para tal fin. En este escenario cientifico-tecnologico se enmarca la presente Tesis Doctoral. El objetivo general es desarrollar metodos eficaces de sintesis con tamano controlado. Con las vesiculas obtenidas se han mimetizado exosomas (vesiculas extracelulares) con el fin de investigar su uso como standard analitico en inmunoensayos. Estas vesiculas estan despertando un gran interes en el campo de la salud como nuevos biomarcadores, y son necesarias nuevas aproximaciones para poner a punto metodos de analisis. Tras una introduccion sobre las generalidades de las nanovesiculas, el quinto capitulo de la tesis presenta una profunda revision del estado del arte del concepto de exosoma artificial, asi como la revision critica de las diferentes aproximaciones metodologicas para su produccion y una nueva clasificacion de estos nuevos biomateriales en funcion de los mismos. Ademas, se han expuesto los usos biotecnologicos de dichas particulas, como son la distribucion y liberacion controlada de farmacos, su papel en diagnostico, y su posible empleo en el desarrollo y estudio de metodos bioanaliticos. Para ello, es necesario procesos adaptados para la preparacion de exosomas puramente artificiales mediante tecnicas nano-biotecnologicas. Esta tematica es precisamente sobre la que versa el trabajo experimental expuesto en los siguientes capitulos. El sexto capitulo presenta el desarrollo de un modelo matematico multivariante de Diseno de Experimentos y su aplicacion al estudio de un metodo clasico de preparacion de nanovesiculas, como es la inyeccion de etanol. Con dicho estudio se pretende controlar los parametros para la obtencion de particulas con propiedades morfologicas deseadas y controladas. Para llevar a cabo el trabajo se han escogido dos formulaciones clasicas: una de liposoma y otra de niosoma. Ademas, se ha realizado un estudio de parametros adicionales como la estabilidad coloidal y la eficacia de encapsulacion de compuestos de diferente naturaleza quimica. En el septimo capitulo se ha abordado la produccion de niosomas de tamano controlado y monodispersos mediante un dispositivo de microfluidica a temperatura controlada. El sistema ha sido disenado para su acoplamiento sobre un microscopio invertido con el fin de observar los fenomenos de interfase acaecidos en su interior (como por ejemplo fenomenos de difusion molecular en flujo laminar). Ademas, se ha estudiado el efecto de parametros metodologicos, poniendo especial enfasis en la temperatura. Tambien se han tenido en cuenta otros parametros como la longitud de la cadena hidrocarbonada del tensioactivo. Este sistema miniaturizado es idoneo para etapas de optimizacion de formulaciones y para la evaluacion de la eficacia de encapsulacion de las mismas, especialmente en los casos en que se disponga de poco volumen de reactivos. En el octavo capitulo se estudia la mejora de la encapsulacion de compuestos hidrofilos mediante el empleo de disoluciones acuosas con poli-oles (glicerol y polietilenglicol), y el efecto de estas sobre el tamano de vesicula. Por otra parte, se evalua el impacto sobre dichos parametros que puede tener el peso molecular de los compuestos encapsulados. Este estudio se ha llevado a cabo con el empleo de una formulacion basada en una mezcla de surfactantes no ionicos en presencia y ausencia de dodecanol como estabilizante de membrana. Finalmente, en el noveno capitulo se parte de los modelos obtenidos para niosomas en etapas anteriores, y han sido empleados para obtener particulas de tamano y monodispersidad similar a exosomas naturales. Ademas, mediante la funcionalizacion superficial de los mismos con estreptavidina y posteriormente con peptidos biotinilados recombinantes de tetraspaninas (principal marcador molecular de exosomas), se han desarrollado exosomas artificiales. Dichos exosomas han sido testados mediante immunoensayos de tipo ELISA como un posible nuevo estandar analitico para el desarrollo y/o mejora de metodos bioanalitcos basados en el reconocimiento molecular para la determinacion de vesiculas extracelulares, como son los exosomas.