hVEGF165 及hBMP-7 共表达重组腺相关病毒载体的体外生物学活性研究

目的 通过体外实验探讨hVEGF165 和hBMP-7 共表达重组腺相关病毒载体（recombinant adenoassociated virus，rAAV）体外生物学活性，为体内应用其进行骨坏死的基因治疗奠定理论基础。 方法 分别采用rAAVhVEGF165-内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site，IRES）- hBMP-7（实验组）、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的rAAV-IRES-GFP（对照组）转染体外培养的第3 代兔BMSCs，于转染后1、2、3、7 及14 d 应用ELISA 法及转染后14 d 应用Western blot 法鉴定两组hVEGF165 和hBMP-7 表达；转染后14 d 行细胞免疫荧光染色观察hVEGF165 和hBMP-7 表达一致性。应用第3 代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）管状血管形成实验检测hVEGF165 蛋白活性。取第3 代BMSCs 行诱导成骨实验，Gomori 钙钴法ALP 染色及茜素红法钙盐染色检测hBMP-7 蛋白活性。 结果 ELISA 检测示随转染时间延长，两组hVEGF165 和hBMP-7 表达逐渐升高；实验组各时间点hVEGF165 和hBMP-7 表达量均明显高于对照组（P lt; 0.05）。Western blot 检测示实验组可见hVEGF165 和hBMP-7表达，对照组未见阳性表达。细胞免疫荧光染色观察示实验组hVEGF165 和hBMP-7 染色呈阳性，表达部位和强度具有较好一致性；对照组未见阳性表达。HUVEC 管状血管形成实验示实验组HUVEC 拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构；与对照组相比，管状血管数比较差异有统计学意义（P lt; 0.05）。ALP 染色见实验组细胞出现深染颗粒，对照组细胞内浅着色；与对照组相比，矿化结节数比较差异有统计学意义（P lt; 0.05）。 结论 双基因共表达rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7体外具有良好的生物学活性。