Aromaten- und Chloraromatenabbau durch Pseudomonas sp. Stamm B13: 3-Oxoadipat:SuccinylCoA-Transferase und 3-OxoadipylCoA-Thiolase

Die 3-Oxoadipat:SuccinylCoA-Transferase und die 3-OxoadipylCoA-Thiolase aus Pseudomonas sp. B13 wurden gereinigt und untersucht. Eine Methode zum Nachweis verschiedener CoA-Ester durch HPLC wurde im Rahmen dieser Arbeit etabliert. Eine native Molekularmasse der B13-Transferase von 115 ± 5 kDa wurde ermittelt. Durch SDS-PAGE wurden zwei Enzymuntereinheiten A und B mit Grosen von 32,9 und 27,0 kDa nachgewiesen. Diesen Daten entsprechend handelt es sich bei der B13-Transferase um ein heterotetrameres Enzym des Typs A 2 B 2 mit einer Molekularmasse von 119,8 kDa. Die N-terminale Aminosauresequenz der Enzymuntereinheiten der B13-Transferase wurden wie folgt bestimmt: Untereinheit A: AELLTLREAVERFVNDGTVALEGFTHLIPT . Untereinheit B: SAYSTNEMMTVAAARRLKNGAVVFV . Ein Vergleich dieser Sequenzen mit Transferasen aus anderen Aromaten-abbauenden Organismen belegt eine geringe Identitat. Die K M - und V max -Werte der Transferase betragen 0,4 mM bzw. 10,3 U/mg Protein fur 3-Oxoadipat und 0,2 mM bzw. 24,2 U/mg Protein fur Succinyl-CoA. Die katalytische Konstante betragt 1430 min-1. Die B13-Transferase setzt keine in 2- und 4-Position halogenierten 3-Oxoadipate um. Auch 2-Methyl-3-oxoadipat ist kein Substrat der Transferase. Eine sehr geringe Transferase-Aktivitat konnte gegenuber 4-Methyl-3-oxoadipat, sowie fur 2-Oxoadipat und 3-Oxoglutarat gezeigt werden. Eine native Molekularmasse der B13-Thiolase von 162 ± 13 kDa wurde bestimmt. Durch SDS-PAGE wurde eine Grose von 42 kDa fur die Enzymuntereinheit der B13-Thiolase ermittelt. Entsprechend der gefundenen Daten ist die B13-Thiolase ein homotetrameres Enzym des Typs A 4 mit einer Molekularmasse von 168 kDa. Die N-terminale Aminosauresequenz der Enzymuntereinheit der B13-Thiolase wurde bestimmt: Untereinheit: SREVYI?DAVRTPIGRFG (? = unbestimmte Aminosaure). Ein Sequenzvergleich zu Thiolasen anderer Organismen zeigt einen hohen Grad an Ubereinstimmung. Die K M - und V max -Werte der B13-Thiolase betragen 0,15 mM bzw.1,5 U/mg Protein fur 3-OxoadipylCoA und 0,01 mM bzw. 0,9 U/mg Protein fur CoA. Die katalytische Konstante betragt 470 min-1.