Padronização do Kit PowerPlex Y 23 para análise de mutações cromossomo Y

Introducao: A tecnologia mais recente na Genetica Moderna e a amplificacao de regioes do DNA conhecidas como microssatelites ou STRs (Short Tandem Repeats) atraves da reacao de PCR (MULLIS, K.B; FALOONA, F.A.). Em geral, analisar 20 STRs autossomicos e suficiente para identificacao humana e em casos de paternidade que envolve suposto pai, mae e filho (YUAN, L.). Mas em casos mais complexos, analises de marcadores presentes nos cromossomos sexuais e no DNA mitocondrial podem contribuir. Os marcadores do cromossomo Y dessas regioes sao aplicados em analises de parentesco, em casos que o suposto pai nao esta disponivel para o exame, mas existem outros parentes masculinos da linhagem paterna (FRANCEZ P.A.C.), denominados reconstituicoes, em que e necessaria a reconstrucao genetica atraves da linhagem patrilinear. Em testes de paternidade, mutacoes espontâneas em celulas germinativas do suposto pai podem levar a falsas exclusoes durante as analises, para isso sao necessarias estimativas confiaveis de taxas de mutacao de Y-STRs para a interpretacao exata dos dados. Objetivo: O protocolo Promega sugere a amplificacao dos Y-STR em uma reacao com volume final de 25µL. Para que pudesse otimizar os custos das reacoes do laboratorio sem interferir na sensibilidade e interpretacao dos dados, o presente projeto tem como objetivo avaliar a viabilidade deste Kit utilizando o volume final para 5µL, mantendo a proporcao de 2:1 de PowerPlex®Y23 5X Master Mix e 10X Primer Pair Mix respectivamente, e a concentracao de 0,5 ng de DNA modelo, para possivel reducao de custos para o laboratorio. Metodologia: Serao selecionados 10 casos com paternidade confirmada no LIP-FCFAr de individuos nascidos no estado de Sao Paulo, que ja foram feitas analises previas com Kit PowerPlex Y23 seguindo as recomendacoes do fabricante. Estas amostras estao armazenadas em cartao FTA, e serao feitas extracoes do DNA utilizando o protocolo descrito por Singer-Sam, et al. (1989). A reacao de PCR para analise dos 23 Y-STR sera realizada com o auxilio do kit PowerPlex Y 23, com as alteracoes de volumes para a obtencao de um volume final de mix de 5µL, porem mantendo as concentracoes de cada reagente conforme descrito pelo fabricante. Os produtos de PCR amplificados serao submetidos a eletroforese capilar para analise dos fragmentos no analisador genetico ABI 3500 e os perfis obtidos dela, serao verificados e analisados no software GeneMapper ID-X e comparados com os perfis que foram anteriormente genotipados. Resultados e discussao: Com a analise dos eletroferogramas obtidos, observa-se efetiva amplificacao dos marcadores, sendo possivel a genotipagem precisa das amostras utilizando volume reduzido do Kit. Cada amostra genotipada com volume reduzido foi comparada com as obtida anteriormente e em todas as comparacoes feitas, nao houve alteracao em nenhum marcador, quando comparado aos perfis obtidos com as recomendacoes do protocolo original. Conclusao: As PCRs de PowerPlex®Y23 se mostram efetivas na padronizacao com reducao de reagentes, podendo ser reproduzido em outras atividades. Os resultados coletados beneficiam a rotina laboratorial, visto que kits reacionais de biologia molecular comumente tem altos custos.