里氏木霉 Cel5A 基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达

内切纤维素酶Cel5A缺乏是限制纤维素酶制剂高效酶解天然纤维素的关键因素。本文尝试构建高效表达里氏木霉Cel5A的毕赤酵母重组菌株以弥补目前Cel5A的天然分泌不足，通过基因密码子偏好性优化里氏木霉Cel5A基因和构建表达载体pPIC9K- eg2 ，并将其电转入毕赤酵母GS115以构建重组子，利用浓度梯度平板和摇瓶发酵筛选获得一株高产毕赤酵母 Pichia pastoris 菌株GS115-EG Ⅱ。重组酶的酶学性质分析显示，该酶分子量50 kDa、最适pH (pH 4.5) 略有降低及最适反应温度为60 ℃，专一性地作用于非结晶纤维素，与天然里氏木霉Cel5A并无明显区别。通过摇瓶发酵的初步优化，该菌摇瓶培养条件：培养温度28 ℃、起始 pH 5.0、接种量2%、每24 h添加甲醇1.5% ( V / V )、每24 h添加山梨醇4 g/L及吐温80添加4 g/L，发酵192 h重组酶酶活达到24.0 U/mL。进一步上罐 (5 L) 发酵180 h，该重组酶Cel5A酶活高达270.9 U/mL，蛋白含量达到4.16 g/L。重组毕赤酵母 P. pastoris GS115-EG Ⅱ是一株适合于外源表达Cel5A的工程菌，该重组酶可替代天然分泌Cel5A适用于当前酶基生物炼制模式下木质纤维素基质高效水解中。