Fusion tag-based immobilization methods for the one-step purification and immobilization of enzymes

Die Immobilisierung von Biokatalysatoren ist ein wichtiges Instrument fur die kosteneffiziente Nutzung von Enzymen, da hierdurch sowohl ihre Wiederverwendung als auch verschiedenste Reaktionskonzepte ermoglicht werden. Die derzeitig verfugbaren Methoden sind jedoch kaum generell anwendbar und die Bildung einer gerichteten, vorzugsweise kovalenten Bindung des Enzyms an das Tragermaterial unter Erhaltung der katalytischen Aktivitat ist eher selten. Auserdem konnen derzeit Immobilisate mit hoher Reinheit meist nur durch vorhergehende chromatographische Reinigung der Enzyme hergestellt werden, was mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden ist. Daher wurden in dieser Arbeit Tag-basierte Methoden als einfache und kostengunstige Alternative fur die Immobilisierung von Enzymen evaluiert. Hierfur wurden Enzyme aus den Familien der ThDP-abhangigen Enzyme, Alkoholdehydrogenasen, Transaminasen sowie Aldolasen als Modellenzyme ausgewahlt. Unter den ausgewahlten Tags ermoglicht der HaloTagTM eine kovalente Bindung an Tragermaterialien, auf denen entsprechende Chloroalkane exponiert sind. Der Tag ist kommerziell erhaltlich und wurde artifiziell durch entsprechende Modifizierung des aktiven Zentrums einer Dehalogenase aus Rhodococcus spec. konstruiert. Die Fusion dieses Tags mit den entsprechenden Modellenzymen ergab in allen Fallen eine gute heterologe Produktion mit bis zu 50 % Anteil am loslichen Gesamtproteingehalt. Des Weiteren ermoglicht der HaloTagTM eine schnelle Bindung der Fusionsenzyme direkt aus Rohzellextrakten an die Tragermatrix, was zu Immobilisaten mit hoher Enzymreinheit fuhrte. Alle Modellenzyme waren im Anschluss katalytisch aktiv, wobei die Aktivitat im Vergleich zu den freien Referenzenzymen ohne HaloTagTM zwischen 10 % und 100 % variierte. Fur die Mehrzahl der untersuchten Enzyme wurde jedoch eine Restaktivitat hoher als 50 % beobachtet und im Falle der immobilisierten Aldolase konnte die Aktivitat durch Auswahl von langen, starren Abstandshaltern, die den HaloTagTM mit dem Modellenzym verknupften, erhoht werden. Die so hergestellten Immobilisate wurden im Anschluss sowohl fur die Rezyklierung in Satzreaktoren als auch fur die Etablierung von kontinuierlichen Reaktionen verwendet. Hierfur wurden effiziente Protokolle entwickelt, die eine direkte Beladung von Stromungsrohr-Reaktoren im Fluss erlauben, sodass Reaktionen direkt im Anschluss durchgefuhrt werden konnen. Mithilfe dieser Reaktionskonzepte wurde die effiziente Produktion von beispielsweise Mono-Aldol Reaktionsprodukten oder die Bildung von chiralen Alkoholen ermoglicht. Insbesondere wurden dadurch aber auch erfolgreich Mehrschritt-Reaktionen etabliert, da durch die raumliche Trennung der einzelnen Reaktionsschritte auftretende Inkompatibilitaten erfolgreich uberwunden wurden. Dies mundete schlieslich in Reaktionen fur die Synthese von chiralen Epoxiden oder vicinalen Diolen, fur die Raum-Zeit Ausbeuten von bis zu 1,8 kg*L-1*d-1 erzielt wurden. Die einzelnen Reaktionen verliefen daruber hinaus bis zu mehrere Wochen stabil. Im Vergleich dazu wurden Kohlenhydrat-Binde Module (CBMs), welche die Bindung an unlosliche Kohlenhydrate ermoglichen, ebenfalls erfolgreich fur die Immobilisierung von Enzymen mit gleichzeitiger Reinigung eingesetzt. Die resultierenden Immobilisate zeigten ahnliche Restaktivitaten wie entsprechende immobiliserte HaloTagTM-Fusionsenzyme. Allerdings wurde in vielen Fallen eine geringe Produktion der Fusionsenzyme und eine geringere Reinheit sowie schwachere Bindungsstarke an Cellulose beobachtet. Daher wurde der HaloTagTM als besonders geeigneter Kandidat fur die erfolgreiche Immobilisierung von Enzymen identifiziert. Generell ist diese Methode einfach durchzufuhren und auf eine Vielzahl an Modellenzymen anwendbar, was damit das Potential birgt, die oftmals aufwandige Entwicklung von immobilisierten Biokatalysatoren deutlich zu beschleunigen und zu vereinfachen.