Etude cinetique du marquage d'affinite de la proteine kinase c par la n-tosyl-l-lysine chloromethylcetone

Nous avons etudie les cinetiques d'inactivation de la proteine kinase c (pkc) de cervelle de buf par la n-tosyl-l-lysine chloromethylcetone (tlck). Lorsque la pkc est au repos, les courbes d'inactivation en semilog sont non lineaires. A chaque concentration, un plateau d'activite residuelle est atteint apres un certain temps. La valeur du plateau est inversement proportionnelle a la concentration en tlck. Mais ce phenomene n'est pas du a une disparition du reactif. D'autre part, en presence de calcium, phosphatidylserine et phorbol 12-myristate 13-acetate, la perte d'activite suit une cinetique de saturation dont le ki est 0,0006 s-1 et ki est 1,9 mm. Les etudes de protection par atp. Mg et l'histone necessitent la presence de glycerol 50% dans le milieu d'incubation, sans quoi le controle (la kinase en presence d'activateurs et d'un des substrats) perd rapidement son activite. En presence de glycerol, les parametres cinetiques sont significativement modifies (ki est alors egal a 0,2 mm). La protection par l'atp. Mg est de type mixte competitif et non competitif, alors que l'histone protege d'une maniere competitive avec une constante de protection qui a ete mesuree. En presence et en absence de glycerol, la stchiometrie du marquage a ete determinee graphiquement. Les resultats suggerent qu'une mole de reactif est suffisante pour inactiver l'enzyme. Ces resultats semblent indiquer que le tlck marque le domaine catalytique au site actif lorsque la pkc est activee, alors que pour la pkc au repos, le site actif est masque. Dans la proteine non activee, le site du marquage serait different