Estudio de microRNAs implicados en la respuesta renal a isquemia-reperfusión : identificación como nuevos biomarcadores de daño renal agudo

La insuficiencia renal aguda (IRA) es un sindrome clinico complejo que presenta una alta tasa de morbilidad y mortalidad en los paises desarrollados. A pesar de la intensa investigacion de las ultimas decadas, los metodos de diagnostico del dano renal y su terapeutica han experimentado pocos avances, probablemente debido a que las herramientas clinicas actuales ofrecen una informacion de diagnostico tardia. La identificacion de nuevos mecanismos moleculares implicados en la patofisiologia de la IRA es esencial para el desarrollo de nuevas herramientas de diagnostico y el descubrimiento de nuevas dianas terapeuticas. Los microRNAs son reguladores post-transcripcionales implicados practicamente en todos los procesos celulares. Son reguladores finos de la informacion genetica y crecientes evidencias ha demostrado que estan implicados en los mecanismos fisiopatologicos subyacentes a numerosas de enfermedades, incluyendo nefropatias. En este trabajo hemos identificado y caracterizado varios miRNAs como mediadores clave de la respuesta del tubulo proximal al dano por Isquemia/Reperfusion (I/R). Asi mismo, hemos desvelado el papel de estos miRNAs como biomarcadores diagnosticos, pronosticos y de predisposicion de IRA. Para ello hemos utilizado un modelo in vivo de I/R renal en rata, asi como un modelo in vitro en celulas proximales tubulares que reproduce todos los estimulos y eventos observados in vivo. Adicionalmente, hemos utilizado muestras de suero de pacientes con IRA procedentes de dos cohortes: Pacientes de unidades de cuidados intensivos y pacientes sometidos a cirugia cardiaca. Utilizando estos modelos experimentales de I/R y por medio de microarrays y analisis mediante qRT-PCR, hemos demostrado que miR-127 se modula durante isquemia y tambien durante la reperfusion tanto in vivo como in vitro. Experimentos de interferencia in vitro demostraron que la induccion isquemica de miR-127 es mediada por la estabilizacion del Factor Inducible por Hipoxia-1α (HIF-1α). Asi mismo, miR-127 esta implicado en el mantenimiento de la adhesion celula-celula y celula-matriz, ya que la sobreexpresion de miR-127 mantiene el ensamblaje de los complejos de adhesion focal y la integridad de las uniones estrechas. miR-127 regula tambien el trafico intracelular. De hecho, hemos identificado por primera vez en este trabajo el miembro 3B de la familia de la Kinesina (KIF3B), molecula clave para el trafico intracelular, como una diana real de miR-127 en celulas proximales tubulares de rata. Asi mismo, como los miRNAs pueden ser detectados en fluidos corporales extracelulares, y basandonos en nuestros resultados obtenidos en modelos experimentales, hemos identificado y validado un panel de 10 miRNAs en suero, incluyendo miR-127, como biomarcadores de IRA en pacientes. Un experimento de cribado inicial llevo a la seleccion de un panel de miRNAs en suero que fueron posteriormente validados en una cohorte de pacientes de UCI con dano renal, asi como en una cohorte de pacientes de cirugia cardiaca con circulacion extracorporea. Los experimentos de validacion demostraron que nuestro panel de miRNAs en suero son biomarcadores diagnosticos de IRA con una especificidad y sensibilidad cercana al 100%. Ademas, los miRNAs sericos pueden detectar el desarrollo de IRA antes que el incremento de creatinina, demostrando que son herramientas de diagnostico precoz. Los miRNAs sericos proporcionan informacion clinica adicional valiosa, ya que los niveles de miRNAs en suero correlacionan con la severidad del dano renal y pueden discriminar entre dano renal de origen renal o pre-renal, asi como entre sus etiologias. Asi mismo, los niveles de miRNAs en suero, estimados antes de la cirugia, pueden predecir el desarrollo posterior de dano renal, lo que demuestra su valor como biomarcadores de predisposicion de IRA. [ABSTRACT]Acute Kidney Injury (AKI) is a complex clinical syndrome which presents very high morbidity and mortality rates in developed countries. Despite the intense research of the last decades, AKI diagnosis and therapeutic approaches have undergone few advances, probably due to the fact that current clinical tools offer late diagnosis information. Identification of new molecular mechanisms involved in AKI pathophisiology is essential for development of new diagnostic and prognostic tools as well as discovery of new therapeutic targets. microRNAs (miRNAs) are post-transcriptional regulators of almost every cellular process. They have been unveiled as fine-tuners of genetic information and accumulating evidence has demonstrated that they are at the bases of the pathophysiological mechanism of a wide range of disorders, including nephropaties. In this work, we have identified and characterized several miRNAs as key mediators of the proximal tubule response to I/R injury. Moreover we have point out these miRNAs as AKI diagnostic, prognostic and predisposition biomarkers. For this purpose, we have used an in vivo model of renal ischemia/reperfusion in rat as well as an in vitro model in proximal tubule cells which closely mimics the stimuli and features observed in vivo. Additionally, we have used serum samples of AKI patients from two cohorts: Intensive Care Unit patients and cardiac surgery patients. Using these experimental models of I/R and by means of microarrays and qRT-PCR analysis, we demonstrated that miR-127 is modulated during ischemia and also during reperfusion, in vivo and in vitro. In vitro interference approaches demonstrated that ischemic induction of miR-127 is mediated by Hypoxia Inducible Factor-1alpha (HIF-1α) stabilization. Moreover, miR-127 is involved in cell-matrix and cell-cell adhesion maintenance, since overexpression of miR-127 maintains focal adhesion complex assembly and tight junctions’ integrity. miR-127 also regulates intracellular trafficking. In fact, we have identified for the first time in this work the Kinesin Family Member 3B (KIF3B), key molecule in cell trafficking, as a target of miR-127 in rat proximal tubule cells. Moreover, since miRNAs can be detected in extracellular body fluids, and based in our findings using experimental models, we have identified and validated a panel of 10 serum miRNAs, including miR-127, as biomarkers of AKI in patients. An initial screening experiment led to a panel of serum miRNAs which were validated in bigger cohorts of ICU patients with AKI and patients who underwent cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Validation experiments demonstrated that our panel of miRNAs are powerful diagnostic biomarkers of AKI with sensitivity and specificity close to 100%. Moreover, serum miRNAs detect AKI development before serum creatinine increases, becoming early diagnostic tools. Serum miRNAs provide additional valuable clinical information since miRNA levels in serum correlate with AKI grade and can distinguish between pre-renal and intrinsic AKI origin as well as among AKI etiologies. Moreover, serum miRNAs levels estimated before surgery can predict AKI development later on, becoming biomarkers of AKI predisposition.