Purificação e caracterização da peroxidase do tapereba (Spondias lutea L.)

A peroxidase (EC 1.11. 7.1, doador: peroxido de hidrogenio oxidoredutase) do tapereba (Spondias lutea L.), um fruto nativo da Amazonia com aroma bem caracteristico e de grande uso na fabricacao de sucos, geleias, nectar e sorvete, foi purificada e caracterizada. A extracao da peroxidase ionicamente ligada da polpa do tapereba foi obtida pelo uso do tampao fosfato de sodio 0,2 M, pH 8,0 contendo lOmM EDTA, 0,2M CaCb and 2% PEG na proporcao 1: 1 (polpa:tampao) (v/v). A peroxidase foi purificada por meio de precipitacao com acetona seguida pela filtracao em gel em coluna Sephacryl S-200 em sistema FPLC. A eletroforese da peroxidase purificada em gel de poliacrilamida mostrou uma banda de atividade peroxidativa. A peroxidase bruta do tapereba apresentou atividade otima em pH 4,5 e 35°C e mostrou estabilidade numa ampla faixa de pH (2,6-10) e em temperaturas inferiores a 50°C. A peroxidase purificada foi caracterizada como uma glicoproteina e mostrou atividade especifica igual a 514.320 D/mg, massa molecular 28,5 kDa e ponto isoeletrico 4,8. A peroxidase purificada apresentou atividade otima a 35°C e pH 5,5. A enzima seguiu a cinetica de Michaelis-Menten e o valor de Km foi igual a 20,3 mM para o substrato guaiacol. A enzima purificada mostrou-se estavel numa ampla faixa de pH (pH 2,6-10). A estabilidade termica da peroxidase purificada foi analisada na faixa 10°C-90°C. A enzima mostrou ser estavel ao calor, sendo que apos aquecimento a 70°C durante 60 min, aproximadamente 65% da atividade enzimatica foi mantida. A inativacao termica da peroxidase purificada apresentou um perfil nao linear com o tempo de aquecimento. A isoperoxidase foi totalmente inativada depois do aquecimento a 90°C por 2 min e a atividade enzimatica da peroxidase purificada nao regenerou quando foi mantida a 30°C durante 24 h e a 5°C por 24h, depois da inativacao termica. A peroxidase purificada foi completamente inibida pelo acido ascorbico na concentracao final 1 mM, metabissulfito de sodio e bissulfito de sodio na concentracao final 10 mM, inibidores frequentemente usados no processamento de alimentos. A atividade da peroxidase foi ativada pelo CaCb (1 OmM) e NaCI (1mM), mas foi fortemente inibida pelo CUSO4 (10 mM), Fe2(SO4)3 (lmM) e completamente inibida pelo KCN (lmM). A isoenzima purificada foi parcialmente afetada pelos sais MnSO4, MgSO4, KCl e Na2S04 e pelos compostos quimicos SDS, EDTA, Nbromosuccinimida, iodoacetamida. A atividade da enzima foi totalmente inibida pelo mercaptoetanol na concentracao final 10mM Abstract