TIRF-Mikroskopische Untersuchungen der Insulin-Granula und des Aktin-Zytoskeletts in primären Beta-Zellen und Untersuchungen des zellulären Energiestoffwechsels mit PercevalHR

Bisherige Untersuchungen von Insulin-Granula wurden meist mit dem Fokus auf fusionierende Granula durchgefuhrt, indem diese manuell gezahlt wurden. Das Aktin-Zytoskelett soll bezuglich der Fusion der Granula eine Doppelrolle einnehmen, sowohl als Barriere als auch als Transportstruktur bei Stimulation. Da die Dynamik des Aktins und der Granula energieabhangig sind, ist es auserdem interessant die dynamische ATP/ADP-Ratio in MIN6- und primaren Beta-Zellen zu betrachten. In dieser Arbeit wurde das Verhalten der Insulin-Granula in primaren Beta-Zellen aus NMRI-Mausen mittels TIRF-Mikroskopie betrachtet und Anwender-unabhangig ausgewertet. Auserdem wurden Struktur und Lokalisation des Aktin-Zytoskeletts in Abhangigkeit zu den Insulin-Granula untersucht. Die dynamische Anderung der ATP/ADP-Ratio wurde mit dem PercevalHR-Label bestimmt. Die Insulin-Granula in den Beta-Zellen wiesen eine konstante Bewegung vom Zellinneren zur Plasmamembran und zuruck ins Zellinnere auf. Auf diese Weise wurde jedes Granulum im Durchschnitt innerhalb von 25 Sekunden 13,3-mal an der Plasmamembran ausgetauscht. Es war uberraschend, dass mit einem 30 mM Glucose-Stimulus keine erhohten Exozytoseraten in den Beta-Zellen beobachtet werden konnten. Allerdings konnte eine sehr hohe Aktin-Dichte an der gesamten Kontaktflache zum umstromenden Medium beobachtet werden. Parallele Untersuchung der Granula und des Aktin-Zytoskeletts zeigten eine gegenseitig ausschliesende Lokalisation beider zellularer Strukturen, die in vielen Zellen mit steigender Glucose-Konzentration zunahm. Die Messungen der ATP/ADP-Ratio zeigten beim Wechsel von 0 mM Glucose auf 30 mM Glucose, sowohl in MIN6-Zellen als auch in primaren Beta-Zellen eine deutliche Steigerung. Es konnte gezeigt werden, dass einzelne Beta-Zelle kein ideales Modell ist um die Exozytose von Insulin-Granula zu untersuchen, da diese nicht mit insulinotropen Stimuli wie 30 mM Glucose gesteigert werden konnte. Ein moglicher Grund dafur konnte das Aktin-Zytoskelett sein, das in Einzelzellen sehr dichte Strukturen an der Zellmembran ausbildet. Diese dichten Aktin-Strukturen konnten die Insulin-Granula von der Plasmamembran abschirmen und die Exozytose verhindern. Es ware daher von Vorteil die Exozytose von Insulin-Granula an ganzen Inseln untersuchen zu konnen. Die dynamische ATP/ADP-Ratio lies sich mit PercevalHR in MIN6-Zellen und in primaren Beta-Zellen bestimmen. Der Verlauf der ATP/ADP-Ratio in primaren Beta-Zellen besser reproduzierbar.