Generación y aplicación de anticuerpos monoclonales frente a toxinas marinas y al dinoflagelado alexandrium minutum

Con el fin de disminuir las perdidas economicas sufridas en acuicultura y el alto riesgo para la saludo de los consumidores, ocasionados por episodios toxicos provocados por distintas especies de fitoplancton marino, diversos paises han implementado medidas de control. Las cuales incluyen, el recuento de fitoplancton toxico y el control de toxinas en marisco. El control de fitoplancton toxico se lleva a cabo mediante la identificacion de las caracteristicas morfologicas bajo microscopio optico, tarea lenta y tediosa que requiere personal entrenado. El control de toxinas en marisco tiene como objetivo asegurar que no se superen los limites legales permitidos, para lo cual se han establecido metodos oficiales de deteccion. Sin embargo, algunos de estos metodos, como el bioensayo en raton, presentan importantes desventajas. Con el fin de facilitar los programas de control planteamos en este trabajo tres grandes objetivos. En primer lugar, la inmunodeteccion de microalgas con anticuerpos monoclonales obtenidos mediante la tecnica de produccion de hibridomas, dirigidos frente al dinoflagelado Alexandrium minutum. De los 12 hibridomas obtenidos, dos (M54,3 y M90.3) mostraron gran especifidad frente al dinoflagelado, reconociendolo exclusivamente tanto en muestras de cultivo, como en muestras naturales de fitoplancton procedentes de episodios toxicos. Por lo que su su aplicacion podria facilitar las tareas de monitorizacion. En segundo lugar, nos planteamos la inmunodeteccion de las toxinas marinas Acido domoico (AD) y Palitoxina (PITX) mediante la obtencion de fragmentos de anticuerpos a partir de bibliotecas de fagos recombinantes. Se obtuvieron virus bacteriofagos portadores de fragmentos scFvs capaces de reconocer al acido domoico ELISA indirecto. Sin embargo no fueron efectivos en el desarrollo de un ELISA competitivo para la cuantificacion de la toxina. De los 20 fagos-scFvs obtenidos, capaces de reconocer a la palitoxina en alta intensidad, se seleccionaron los que presentaron mayor absorbancia por ELISA indirecto. Tras analizar sus secuencias nucleotidicas, se selecciono un unico clon, denominado PITx8. Este fago-scFv fue utilizado en el desarrollo de un ELISA competitivo como posible metodo de deteccion de palitoxina en muestras contaminadas. Tras enfrentar al fagoPTX8 a un amplio rango de concentraciones decrecientes de palitoxina libre, se obtuvo una recta de calibrado con un coeficiente de regresion de 0,9945, que permitiria la estimacion de toxina presente en una muestras, dentro de un amplio rango de cuantificacion (0,0005-500ng/ml). La aplicabilidad de este metodo se conformo mediante el analisis de 10 muestras de marisco artificialmente contaminadas con Palitoxina patron, encontrandose que el metodo fue capaz de determinar la concentracion de toxinas en todos los casos. Por ultimo, se llevo a cabo un ensayo comparativo entre los metodos de referencia para la deteccion de toxinas amnesica (AD y derivados) y paralizantes (Saxitoxina y derivados ) y el inmunoensayo. Tras analizar 80 muestras naturalmente contaminadas con toxinas paralizantes, provenientes de nueve especies distintas de marisco bajo varias presentaciones, mediante el bioensayo en raton y un ELISA comercial, se observo que el 90% de las muestras fueron correctamente determinadas por ELISA. La correlacion entre ambos metodos mostro una buena concordancia entre ellos. En cuanto a las toxinas amnesicas se analizaron 58 muestras naturalmente contaminadas con un amplio rango de concentraciones, provenientes de seis especies de marisco, bajo distintas representaciones. Se compararon los resultados mediante el metodo de referencia (HPLC-UV) y el ELISA competitivo ASP (modelo oficial alternativo), encontrandose que el ELISA fue capaz de determinar correctamente el 97 % de las muestras, confirmando que este metodo es una alternativa util, que permite la deteccion de AD en distintas especies de marisco, bajo distintas presentaciones.