PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE QUITINASES DE SEMENTES DE CANAVALIA BRASILIENSIS

Quitinases (EC 3.2.1.14) sao enzimas que hidrolisam o polimero de quitina em residuos de N-acetil-glicosamina atraves da clivagem das ligacoes glicosidicas (β 1-4) as quais podem ser encontradas em todas as partes das plantas. Essas enzimas foram agrupadas nas familias 18 e 19 das glicosil hidrolases, as quais sao enzimas-chave no metabolismo dos carboidratos. Estudos demostraram que a quitinase de Canavalia ensiformis, apresenta baixa similaridade com outras quitinases de origem vegetal e baixa atividade enzimatica, podendo essa enzima atuar como proteina que reconhece carboidratos. Apesar de serem descritas na literatura algumas hipoteses acerca de substituicao de um residuo no sitio ativo, ate o presente momento essas hipoteses ainda nao foram comprovadas. Portanto, nao se sabe ao certo a causa da reducao da atividade enzimatica, tao pouco a funcao dessa proteina na planta. Logo, a purificacao e caracterizacao estrutural da enzima nativa e complexada com inibidores e carboidratos, poderao ajudar a elucidar o mecanismo que ocasiona a reducao da atividade enzimatica, caracterizar o dominio de reconhecimento a carboidratos, bem como, correlacionar com um possivel papel biologico dessa enzima na planta. Durante o desenvolvimento do projeto foram testadas metodologias de extracao e purificacao das quitinases de Canavalia brasiliensis buscando a otimizacao das mesmas, comparando perfis de geis eletroforeticos (SDS-page), bem como sua atividade enzimatica mensurada indiretamente em ensaio in vitro por meio de leitura de absorbância a 585 nM no espectrofotometro. Houve resultados satisfatorios utilizando-se do tampao de extracao (10 mM Na2HPO4, 15 mM NaH2PO4, 100 mM KCl, 1,5% EDTA) a pH 6,0 seguido de um fracionamento por sulfato de amonio de fracoes 0-35% e 35-70% apresentando respectivamente 0,01302 nKAT e 0,00191 nKAT de atividade enzimatica.