In vitro propagation and ex situ conservation of the Western-Mediterranean endemic species Lapiedra martinezii Lag. (Amaryllidaceae)

Lapiedra martinezii Lag. (Amaryllidaceae) es un geofit que creix en comunitats vegetals termofiles i semiarides dominades pel margallo, Chamaerops humilis L., i Osyris lanceolata Hochst. & Steud. i en diversos tipus de de maquies mediterranies i matollars. Tanmateix es troba frequentment en rocalles, escletxes, esquerdes en indrets pedregosos i penya-segats costaners, des del nivell del mar fins als 650 m.s.n.m. a la Peninsula Iberica i el Nord d’Africa (Rios et al., 2013). L. martinezii te un elevat potencial economic degut a la seva riquesa en alcaloides amb gran interes per a la industria quimica i farmaceutica (Larsen et al., 2010; Rios et al., 2013). A banda, es una planta amb potencial interes per a la industria de plantes bulboses ornamentals i tambe te un cert interes en conservacio degut a la relativa baixa abundancia que mostra al llarg de la seva area de distribucio, i a les amenaces que s’han detectat a les seves poblacions (Rios et al., 2013). 1.2.- Les estrategies de conservacio ex-situ: la investigacio en fisiologia de llavors i l’us de tecniques de cultiu in vitro com a eina per a la propagacio sostenible i la conservacio La germinacio te una importancia capital al cicle biologic de les especies vegetals i el seu exit reproductiu, i es pot considerar l’etapa mes vulnerable ja que representa l’entrada de les plantes als ecosistemes (Harper, 1977; Rajjou et al., 2012). Per a moltes especies, el moment de l’any on la germinacio es possible pot ser prou limitat (per exemple, nomes a la tardor, o la primavera, coincidint amb l’estacio humida). No obstant aixo, l’epoca favorable per a la germinacio d’altres especies es prou llarga, per exemple, durant tot el periode de creixement (Baskin i Baskin, 2001). Les plantules de la majoria de les especies vegetals emergeixen tan prompte com les llavors han germinat al sol. Aleshores, el rellotge biologic de l’emergencia de les plantules esta principalment regulat pel trencament de la letargia i la presencia dels requeriments adequats per a la germinacio de les llavors. Per a algunes altres especies, un considerable lapse de temps hi existeix entre el moment de l’eixida de la radicula al camp, i l’emergencia de la plantula. Les llavors son la via mes important de reproduccio i dispersio en plantes (Nikolaeva, 2001). La informacio sobre la germinacio te, potencialment, un gran valor economic, per exemple per a la propagacio d’arbres autoctons amb important valor economic, mates, lianes, herbes i gespes, per a restauracio d’ecosistemes degradats, i planificacio per un eficac control de les males herbes (Baskin i Baskin, 2001). Junt amb aco, el desconeixement de la dormicio en llavors d’especies economicament importants causa perdues economiques (Nikolaeva, 2001). Per tant, la investigacio en la biologia de les llavors i, particularment, en les condicions optimes per al trencament de la dormicio i promoure la germinacio son objectius essencials per plantes amb importancia economica. Ames, la informacio relativa a la fisiologia de la germinacio es necessaria per a establir procediments de conservacio ex situ apropiats i rutines de treball adequades als bancs de germoplasma, aixi com la planificacio de programes de restauracio de la coberta vegetal amb especies autoctones (Baskin i Baskin, 2001; Walters, 2015). Tenint en compte que tant la propagacio vegetativa, com la recol•leccio directa de material vegetal de les poblacions naturals no podria satisfer la demanda de bulbs que podria ser requerida per a proposits industrials, el coneixement de la fisiologia germinativa i el cultiu mitjancant tecniques biotecnologiques, com ara les tecniques de cultiu in vitro (George i Debergh, 2008) semblen ser la via mes adequada per a dur a terme un us sostenible d’aquest recurs, aixi com per a previndre la sobreexplotacio i extincio de les poblacions naturals, com ha passat en altres especies d’interes economic, a priori no amenacades. 2.- Objectius El treball aci presentat s’ha dut a terme amb l’objectiu de desenvolupar un metode apropiat per a la propagacio in vitro de germoplasma de L. martinezii (llavors, plantules, escales de bulbs i bases foliars) que podrien ser emprades per a proposits industrials aixi com estudiar el comportament de les llavors front a l’emmagatzematge amb la intencio de preservar-les ex situ als bancs de germoplasma. Tanmateix, els resultats obtinguts podrien ajudar a establir un procediment general per a la produccio i conservacio de plantes endemiques i amenacades de la familia de les Amaril•lidacies a Espanya. Concretament, els objectius especifics son: 1.- Estudiar les condicions per al venciment de la dormicio i la fisiologia de la germinacio de les llavors de L. martinezii. 2.- Establir diferents cultius in vitro partint de material vegetal divers (llavors, bulbs i fulles) i provar diferents vies morfogeniques (organogenesi directa i indirecta) de L. martinezii, aixi com desenvolupar un protocol de micropropagacio adequat per als bulbs de L. martinezii. 3.- Avaluar el comportament de les llavors de L. martinezii front a l’emmagatzematge, amb la intencio de desenvolupar un protocol apropiat per a la seva conservacio a llarg termini. CONCLUSIONS. - Les llavors de L. martinezii tenen dormicio morfologica ja que els embrions han de creixer dins de la llavor, abans que es produixca l’emergencia del coleoptil. - La germinacio optima es produeix a 20oC amb percentatges de quasi un 100% de germinacio final en llum i obscuritat. - Les condicions de llum van influir a la velocitat de germinacio, pero els percentatges de germinacio final van romandre sense diferencies significatives. - El pretractament de fred va minvar tots els parametres de germinacio a totes les temperatures assajades, mentre que el pretractament de calor els va incrementar. - L’aplicacio exogena de giberelines no va afectar en cap parametre a la germinacio a les concentracions d’entre 0-0.75 g/L, mentre que les proporcions de llavors germinades va decreixer a les concentracions majors d’1 i 2 g/L. - L’establiment de cultius in vitro de L. martinezii es una tasca prou dificil per les elevades proporcions de contaminacio que s’obte durant el proces d’inici de cultiu, degut a la presencia de bacteries endogenes. No obstant aixo, una mescla d’agents antimicrobians formulada amb 500 mg/L de cefotaxima, 5 mg/L d’ampicilina i 15 mg/L de kanamicina durant tres setmanes va ajudar a mantindre els cultius amb uns nivells de proliferacio bacteriana inferiors al 30%. - El medi d’inici de cultiu dissenyat amb Gamborg B5 i suplementat amb 10 g/L de sacarosa, va ser el mes apropiat per a l’inici de cultius in vitro tant de plantules com de bulbs. - Els cultius de plantules en medi MS, suplementat amb 30 g/L de sacarosa, son una bona alternativa per a desenvolupar un stock de material in vitro, que pot mantenir-se sense subcultivar durant 10 mesos a temperatures de cultiu mes baixes (17oC), sense suspendre el creixement. - La millor resposta morfogenetica a la multiplicacio es va obtindre amb el medi solid MS suplementat amb 30 g/L de sacarosa, BA=4 i NAA=0.12 mg/L en termes de produccio de bulbets (5.77 per explant) i calibre (4.07x6.10 mm), com en l’arrelament (96.18%). Ames, la proliferacio d’estructures tipus call va ser relativament baixa (24.84%) en comparacio amb altres medis de multiplicacio provats. - L’arrelament va ser espontani en tots els medis de multiplicacio testats i en una ampla proporcio de les repliques durant el primer periode de subcultiu, amb uns valors variables des de 76.43% fins al 100% (excepcionalment 49.68%). Per tant, no va ser necessari dissenyar una fase especifica d’arrelament amb medis especifics. - El protocol general d’aclimatacio aci provat va tindre un elevat percentatge de plantes supervivents per a ambdos tipus d’explants: plantules (amb una supervivencia del 86% per a les plantules produides in vitro) i bulbs (supervivencia del 89% per als clons procedents d’explants de bulbs) una vegada transferides a condicions ambientals exteriors. - Les condicions d’obscuritat a 26oC van afavorir clarament la induccio de call, el seu creixement i desenvolupament, mentre que el fotoperiode testat amb llum va tindre un efecte marginal en la produccio de calls. - L’aplicacio de 2,4-D es necessaria per a la formacio del call, independentment de la citocinina emprada al medi (BAP o KIN). - Proporcions elevades d’auxines front a citocinines (al menys 2 vegades) van ser necessaries per a la induccio del call i per a arribar a una optima eficiencia en la seva induccio, que ocorre de forma completa als dos-tres mesos de cultiu. - Els calls amb un nivell de desenvolupament optim van mostrar un color groc i quasi tots van ser compactes o lleugerament friables. - Les llavors de L. martinezii poden ser dessecades fins nivells de contingut en humitat del 4.10%, i emmagatzemades a -20o, -80oC o mitjancant immersio en nitrogen liquid, sense cap efecte significatiu en la germinacio. - Pel que fa al comportament de les llavors de L. martinezii front a l’emmagatzematge, les dades aci obtingudes demostren que son ortodoxes.