A MODEL OF CREATINE DEFICIENCY SYNDROMES IN 3D BRAIN CELL CULTURES BY KNOCKDOWN OF GAMT AND SLC6A8 GENES

La creatine joue un role essentiel dans le metabolisme cellulaire par sa conversion, par la creatine kinase, en phosphocreatine permettant la regeneration de l'ATP. La synthese de creatine, chez les mammiferes, s'effectue par une reaction en deux etapes impliquant Γ arginine: glycine amidinotransferase (AGAT) et la guanidinoacetate methyltransferase (GAMT). L'entree de creatine dans les cellules s'effectue par son transporteur, SLC6A8. Les deficiences en creatine, dues au deficit en GAMT, AGAT ou SLC6A8, sont frequentes et caracterisees par une absence ou une forte baisse de creatine dans le systeme nerveux central. Alors qu'il est connu que AGAT, GAMT et SLC6A8 sont exprimes par le cerveau, les consequences des deficiences en creatine sur les cellules nerveuses sont peu comprises. Le but de ce travail etait de developper de nouveaux modeles experimentaux des deficiences en Cr dans des cultures 3D de cellules nerveuses de rat en agregats au moyen de l'interference a l'ARN appliquee aux genes GAMT et SLC6A8. Des sequences interferentes (shRNAs) pour les genes GAMT et SLC6A8 ont ete transduites par des vecteurs viraux AAV (virus adeno-associes), dans les cellules nerveuses en agregats. Nous avons ainsi demontre une baisse de l'expression de GAMT au niveau proteique (mesure par western blot), et ARN messager (mesure par qPCR) ainsi qu'une variation caracterisitique de creatine et guanidinoacetate (mesure par spectrometrie de masse). Apres avoir valide nos modeles, nous avons montre que les knockdown de GAMT ou SLC6A8 affectent le developpement des astrocytes et des neurones ou des oligodendrocytes et des astrocytes, respectivement, ainsi qu'une augmentation de la mort cellulaire et des modifications dans le pattern d'activation des voies de signalisation impliquant caspase 3 et p38 MAPK, ayant un role dans le processus d'apoptose. - Creatine plays essential roles in energy metabolism by the interconversion, by creatine kinase, to its phosphorylated analogue, phosphocreatine, allowing the regeneration of ATP. Creatine is synthesized in mammals by a two step mechanism involving arginine:glycine amidinotransferase (AGAT) and guanidinoacetate methyltransferase (GAMT). Creatine is taken up by cells by a specific transporter, SLC6A8. Creatine deficiency syndromes, due to defects in GAMT, AGAT and SLC6A8, are among the most frequent inborn errors of metabolism, and are characterized by an absence or a severe decrease of creatine in central nervous system, which is the main tissue affected. While it is known that AGAT, GAMT and SLC6A8 are expressed in CNS, many questions remain on the specific effects of AGAT, GAMT and SLC6A8 deficiencies on brain cells. Our aim was to develop new experimental models of creatine deficiencies by knockdown of GAMT and SLC6A8 genes by RNAi in 3D organotypic rat brain cell cultures in aggregates. Specific shRNAs for the GAMT and SLC6A8 genes were transduced in brain cell aggregates by adeno-associated viruses (AAV). The AAV-transduced shRNAs were able to efficiently knockdown the expression of our genes of interest, as shown by a strong decrease of protein by western blotting, a decrease of mRNA by qPCR or characteristic variations of creatine and guanidinoacetate by tandem mass spectrometry. After having validated our experimental models, we have also shown that GAMT and SLC6A8 knockdown affected the development of astrocytes and neurons or oligodendrocytes and astrocytes, respectively. We also observed an increase of cell death and variations in activation pattern of caspase 3 and p38 MAPK pathways, involved in apoptosis, in our experimental model.