Caractérisation de protéines fluorescentes photoconvertibles pour les techniques de microscopie de localisation de molécules uniques avancées

La microscopie de fluorescence est une puissante technique pour l'observation d'echantillons biologiques et la comprehension de processus moleculaires. Les deux dernieres decennies ont ete temoins de grandes avancees dans ce domaine, notamment avec le developpement des techniques de "super-resolution", qui permettent l'observation de structures plus fines que la limite de diffraction de la lumiere visible (~200 nm). Une de ces techniques les plus populaires est le PALM (Photoactivated Localisation Microscopy, microscopie par localisation photoactivee), qui utilise des proteines fluorescentes phototransformables (PTFPs) pour observer des molecules uniques, et les localiser avec une precision de 10-20 nm. Les PTFPs sont des proteines de la meme famille que la GFP (Green Fluorescent Protein, proteine fluorescente verte), qui non-seulement produisent de la fluorescence, mais peuvent aussi subir des reactions photo-induites, comme l'activation de fluorescence ou le changement de couleur d'emission. Ces proprietes sont a la base du PALM, puisqu'elle permettent la separation temporelle stochastique des emissions de fluorescence, et l'imagerie de molecules uniques. Le fait que le PALM detecte des molecules uniques a conduit au developpement d'un grand nombre d'applications, dont le sptPALM (single-particle tracking PALM, suivi de molecules uniques en PALM) et le PALM quantitatif (qPALM). Ces applications avancees permettent deja d'acquerir des informations precieuses sur le fonctionnement des systemes biologiques, mais leur utilisation reste difficile. Une des raisons en est le comportement photophysique complexe des PTFPs, qui va au-dela des transformations utiles pour l'imagerie PALM. L'objet de cette these etait donc de caracteriser les reactions photo-induites subies par les proteines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs, qui sont parmi les marqueurs les plus populaires en PALM), dans le but d'ameliorer les approches de suivi de molecules uniques et quantitatives en PALM. En particulier, ce travail cherchait a comprendre les pertes transitoires de fluorescence, connues sous le terme de scintillement (blinking en anglais), qui sont detrimentales aux experiences PALM. Une caracterisation poussee des reactions photo-induites ayant lieu dans les formes verte et rouge de la PCFP etudiee nous a suggere une strategie pour reduire l'influence du scintillement, et des artefacts qu'il produit. Enfin, cette strategie a ete appliquee a une experience de qPALM. Ce travail constitue un pas en avant vers une meilleure comprehension de la photophysique des PCFPs, et une meilleure extraction d'informations quantitatives des donnees PALM.