Análise de novos protótipos leishmanicidas : inibição seletiva de topoisomerase de Leishmania sp. por substâncias naturais e semissintéticas

A leishmaniose e uma das mais importantes doencas tropicais negligenciadas em termo de escobertas e desenvolvimento de farmacos. Alem disso, a quimioterapia usada para tratar esta doenca provou ser altamente toxica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito leishmanicida de derivados da propolis coletada na regiao semiarida da Bahia e uma serie de alcamidas naturais, sinteticas e modificadas, bem como, avaliar a acao destes sobre a atividade enzimatica de topoisomerase de Leishmania e humana. O estudo quimico da propolis foi realizado atraves da analise por espectrometria de massas de alta resolucao; e as alcamidas foram obtidas a partir das reacoes de preparacao de cloreto de acidos, de preparacao das amidas a partir de cloreto de acido e amina e da aminolise da feniletilamina com o p-hidroxi-cinamato de metila. Os efeitos citotoxicos foram avaliados em macrofagos J774, atraves do ensaio de MTT. O efeito inibidor, a partir de ensaios in vitro, sobre formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis e L. chagasi foram avaliados atraves do ensaio de MTT e do ensaio de celulas J774 infectadas com formas promastigotas destas especies, respectivamente. O efeito inibidor sobre formas promastigotas e amastigotas de L. infantum iFRP70 foi avaliado atraves da capacidade de emissao de luz infravermelha pelas cepas marcadas pela proteina iFRP70. A inibicao da atividade da enzima topoisomerase foi avaliada atraves do relaxamento do DNA superenovelado, apos analise de eletroforese em gel de agarose. A formacao de complexo de clivagem foi avaliada atraves da capacidade de manutencao do corte na fita de DNA ao longo 30 minutos, apos analise de eletroforese em gel de agarose. O extrato etanolico, as fracoes hexânica, acetato de etila e metanolica da propolis, bem como os flavonoides naringenina e isoramnetina, nao apresentaram efeitos deleterios sobre as celulas J774 ate a maxima concentracao testada (100 μM). Das 16 alcamidas testadas, apenas tres apresentaram efeitos deleterios sobre as celulas J774 a partir da concentracao de 10 μM. A fracao acetato afetou o crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis e L. chagasi, com percentuais de efeito maximo, na concentracao de 10 μM, iguais a 82,2% e 75,5%, respectivamente, valores significativos quando comparados ao farmaco pentamidina. Os flavonoides naringenina e isoramnetina tambem afetaram significativamente o crescimento de formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis e L. chagasi. Estes flavonoides afetaram a atividade enzimatica da topoisomerase de leishmania, interferindo na capacidade da enzima em relaxar o DNA superenovelado, formado durante o processo de replicacao de DNA. Os mesmos flavonoides nao foram capazes de interferir na atividade enzimatica da topoisomerase humana. Em relacao as alcamidas testadas, aquelas denominadas RAC4, RAC8, RAC9, RAC12 e RAC16, apresentaram um efeito significativo contra formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, L. chagasi e L. infantum iFRP70, com concentracao inibitoria de 50% (CI50) abaixo de 10 μM, efeito maximo acima de 60%. Estas alcamidas, quando testadas em concentracoes variando de 100 a 3,15 μM μM, inibiram a capacidade da topoisomerase de leishmania em relaxar o DNA superenovelado, interferindo de forma significativa na atividade enzimatica, com destaque para a RAC8 que foi capaz de inibir a atividade a partir de 6,25 μM, menor concentracao inibitoria observada. Estas alcamidas nao inibiram a atividade enzimatica da topoisomerase humana, em nenhuma das concentracoes testadas, garantido a inibicao seletiva da DNA topoisomerase de leishmania. Quando avaliada a capacidade de formacao de complexo de clivagem, as alcamidas RAC4, RAC8, RAC9, RAC12 e RAC16, foram capazes de manter a estabilidade de formacao do complexo de clivagem, mantendo o DNA cortado ao longo de 30 minutos. Dessa forma, esse trabalho demonstrou que as substâncias naturais e semissinteticas, apresentaram um efeito leishmanicida contra L. amazonensis, L. chagasi e L. infantum iFRP70, bem como inibiram, de forma seletiva a atividade catalitica da enzima DNA topoisomerase de leishmania, podendo vir a ser utilizado como prototipo para o desenvolvimento de novos farmacos leishmanicidas.