哈维氏弧菌( Vibrio harveyi )ML01株胞外产物及分泌性蛋白的分离与特性分析

本研究以引起珍珠龙胆石斑鱼[ Epinephelus fuscoguttatus (♀) × Epinephelus lanceolatus (♂)]幼鱼“皮肤溃疡病”的哈维氏弧菌( Vibrio harveyi ) ML01株为研究对象，采用平板膜覆盖技术和柱层析技术，分离、纯化了ML01株的胞外产物及分泌性蛋白。应用毒性试验、质谱分析与分子克隆技术，对纯化的胞外产物和3种主要的分泌性蛋白进行了特性分析与鉴定。结果显示，哈维氏弧菌ML01株的胞外产物(Extracellular products，ECPs)具有酯酶、明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶活性，无脲酶活性。ECPs对羊红细胞无溶血性，对斑马鱼( Danio rerio )的半数致死剂量(LD 50 )为19.55 μg/g鱼体重。从ML01株中分离到3种主要的分泌蛋白P42、P36、P31，其分子量分别为42、36、31 kDa。经质谱鉴定和分析，这3种蛋白分别为哈维氏弧菌的外膜蛋白OmpU和OmpN，以及一种功能未知的蛋白。利用同源克隆，成功地从ML01株基因组中扩增到了P42、P36、P31的基因。序列测定和比对结果显示，ML01株的这3个基因与哈维氏弧菌ATCC 33843(GenBank CP009467) 的相应基因相比，其开放阅读框(Open reading frame，ORF)序列的相似性分别为97.08%、100%、99.67%，其编码的多肽序列的相似性分别为99.71%、100%和99.93%。本研究对进一步分析哈维氏弧菌ML01株的致病机理、研发该菌的亚单位疫苗具有重要的参考价值。