Recrutement des tétraspanines CD9 et CD81 au niveau des sites de bourgeonnement lors de l’assemblage de la protéine virale Gag analysé par microscopie corrélative combinant microscopie à force atomique (AFM) et la microscopie super résolue (dSTORM)

Les tetraspanines sont des proteines transmembranaires de la membrane plasmique qui forment un reseau d'interactions proteiques, appele "Tetraspanin Web", entre tetraspanines ou avec d'autres proteines partenaires. Elles ont egalement la capacite de s'organiser en microdomaines membranaires appeles TEM (Tetraspanin-Enriched Microdomains). Ces proteines sont impliquees dans plusieurs mecanismes cellulaires et associees a de nombreuses pathologies. La diversite de leurs interacteurs reflete la pleiotropie de leurs fonctions.. Entre autres, elles jouent un role determinant au cours des processus infectieux et notamment lors du bourgeonnement du VIH-1. Des etudes recentes menees au laboratoire ont plus particulierement demontre, a l’echelle de la molecule unique, que les tetraspanines CD9 et CD81 etaient specifiquement recrutees au niveau des sites d'assemblage de la proteine virale Gag. Ces travaux ont ete faits dans un systeme modele de cellules HeLa transfectees par Gag-GFP, dans lesquelles se forment des sites de bourgeonnement de pseudo-particules virales de type VIH-1. Ces observations soulevent plusieurs questions quant a l’implication des tetraspanines CD9 et CD81 dans le mecanisme d’assemblage du virus, notamment dans le remodelage de la membrane plasmique de la cellule hote et sa courbure lors du bourgeonnement, deux phenomenes auxquels les tetraspanines sont associees. Dans ce contexte, le principal objectif de ma these a ete de determiner l'organisation structurale des sites d'assemblage du VIH-1 en utilisant une nouvelle methodologie combinant la microscopie a force atomique (AFM) et la microscopie super resolue de type dSTORM. La microscopie dSTORM fait partie des techniques basees sur la localisation de molecules individuelles et permet de cartographier des proteines fluorescentes avec une resolution laterale inferieure a 50nm tandis que l'AFM permet de determiner la topographie membranaire avec une resolution du meme ordre. La premiere partie de ma these a consiste a construire ce nouveau montage experimental, en collaboration avec l'equipe de Marcelo Nollmann. Nous avons confirme en premier lieu que les sites regroupant Gag-GFP correlaient bien avec des protrusions membranaires caracterises par AFM Nous avons montre que les tetraspanines CD9 etaient specifiquement recrutees au niveau de ces sites de bourgeonnement et que leur recrutement correlait avec le degre de maturation des bourgeons Gag-GFP qui depend du diametre et de la hauteur des sites de bourgeonnement. En plus d’une redistribution des tetraspanines au cours du processus d’assemblage des nouveaux virions, nous avons pu observer une depletion des tetraspanines CD9 et CD81 a la surface des cellules exprimant la proteine virale Gag-GFP. Ces resultats preliminaires revelent la capacite des proteines virales Gag a modifier specifiquement l’environnement de la cellule hote en modulant la repartition et l’expression des tetraspanines au niveau de la membrane plasmique, suggerant un role determinant des tetraspanines au cours de la replication du virus VIH-1.