Avaliação das condições de purificação da enzima β-galactosidase recombinante

A enzima β-galactosidase (lactase) e responsavel pela hidrolise do dissacarideo lactose, resultando em seus constituintes monossacarideos glicose e galactose. E amplamente explorada na industria alimenticia, para producao de leite e derivados com baixo teor de lactose, assim como na industria farmaceutica, devido a crescente demanda de pessoas intolerantes a lactose. As β-galactosidases podem ser produzidas por microrganismos, estes sao as principais fontes de obtencao da enzima para utilizacao industrial. Atraves da tecnica do DNA recombinante, a expressao em Escherichia coli da β-galactosidase de Kluyveromyces surge como alternativa inovadora de otimizacao do processo produtivo. Esta tecnica, assim como diversos processos biotecnologicos, envolve a necessidade da purificacao do bioproduto de interesse. O objetivo do presente trabalho foi determinar as condicoes de purificacao da enzima recombinante β-galactosidase, testando e avaliando a eficiencia de diferentes tecnicas. Cepas de E. coli recombinante BL21(DE3) transformadas com o gene que codifica a β-galactosidase de Kluyveromyces sp., foram cultivadas em batelada alimentada, em biorreator de 2 L em condicoes previamente determinadas. As celulas cultivadas foram resuspendidas em tampao TRIS HCl 50mM pH 7,5 (Tp-THCl), rompidas por pressao (Prensa de French) e a fracao soluvel (extrato enzimatico) foi recolhida. Esta fracao passou por uma etapa de clarificacao, atraves de centrifugacao (13000 rpm, 10 min, 4°C) e por uma etapa de precipitacao do DNA utilizando sulfato de estreptomicina 1%. A fracao soluvel foi entao dialisada em Tp-THCl. Com a amostra, livre de DNA, foram testadas as tecnicas de purificacao de troca anionica, utilizando as colunas cromatograficas Q XL HiPrep e Q HP HiPrep, e de interacao hidrofobica, utilizando a coluna Source 15Phe, respectivamente, em sistema AKTA Purifier (GE Health Care). Entre cada etapa cromatografica a amostra foi dialisada com Tp-THCl e tratada com sulfato de amonio 750 mM para aplicacao na coluna de interacao hidrofobica. A avaliacao da eficiencia das tecnicas testadas ocorreu pela analise da concentracao de proteina, atraves de diferentes cumprimentos de onda, durante o processo de purificacao; expressao da β-galactosidase, utilizando eletroforese vertical em geis de poliacrilamida 12 %; quantificacao de proteinas, atraves do metodo de Bradford; e determinacao da atividade da enzima β-galactosidase utilizando ONPG (o-nitrofenol-β-D-galactopiranoside) como substrato. A melhor separacao, concentracao da enzima e o maior rendimento do processo (aproximadamente 50%), foram observados utilizando apenas a coluna cromatografica Q HP HiPrep. Nao houve a purificacao total da β-galactosidase mas, em todas as tecnicas testadas, a proteina foi expressa em grande quantidade e manteve atividade enzimatica.