海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E．coli中的高效表达

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的表达水平.用PCR方法从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20(b)中构建成质粒pET-amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyA Ⅰ基因插入pET-20(b)中构建成质粒pET-amyA Ⅰ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET-amyA Ⅰ中构建成质粒pET-amyAⅡ.将重组质粒分别转化到E.coli JM109(DE3),并将重组质粒pET-amyA Ⅰ转化E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL.通过IPTG诱导测酶活性:在E.coli JM109(DE3)中表达的重组酶(pET-amyA)、(pET-amyA Ⅰ)、(pET-amyAⅡ)的酶活分别是1658.0 U/mL、6721.7 U/mL、8904.5 U/mL,在E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中表达的重组酶(pET-amyA Ⅰ)的酶活是13867.7 U/mL.表明通过这些手段能大幅提高T. maritima胞外α-淀粉酶在E.coli中的表达水平.