牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用多重荧光定量RT-PCR (real-time RT-PCR)方法，提高对多病原检测的速度和灵敏度，促进对犊牛腹泻的快速诊断和及时治疗。分别在牛星状病毒(BAstV)ORF2基因，牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)5'端非编码区，牛冠状病毒(BCV)N pro基因和牛轮状病毒(BRV)VP6基因的保守基因序列设计、合成并试验筛选了四对有效的特异性引物和探针。进一步利用含4种病毒目的片段的重组质粒，对引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化，建立了Real-time RT-PCR标准曲线，并对四重Real-time PCR方法的特异性、敏感性、重复性和各种临床样本的适用性进行了评价。结果显示：Real-time RT-PCR最适退火温度和时间分别为50.0℃和45 s，BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的引物浓度分别为300、300、400和500 nmol·L-1，探针浓度分别为250、150、100和300 nmol·L-1。对BVDV-1、BCV和BRV的最低检测限均为102copies·μL-1，对BAstV的最低检测限为103 copies·μL-1，具有良好的特异性和重复性。该方法对临床采集的粪样的阳性检出率高于PCR方法。上述结果表明，建立的四重Real-time RT-PCR方法可以用于犊牛腹泻常见病原BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的快速鉴别诊断。