应用GST pull—down技术筛选水稻抗稻瘟病蛋白PID3互作蛋白的研究

Pid3是从水稻中克隆获得的编码CC-NBS-LRR类蛋白的稻瘟病抗病基因。为了更深入地研究Pid3编码蛋白PID3介导的稻瘟病抗性的分子调节机制,我们应用GST pull-down结合质谱技术,对水稻抗稻瘟病蛋白PID3的互作蛋白进行了鉴定和分析。首先,成功构建了带有GST标签且能够表达PID3的CC-NBS结构域的融合蛋白表达载体pGEX6P1-PID3CC-NBS,经诱导表达和GST beads纯化后获得GST-PID3^CC-NBS融合蛋白。我们以Pid3的转基因水稻纯合株系Pid3-TP309为研究材料,分别用对其致病和不致病的稻瘟病菌生理小种ZB13和ZHONG-10-8-14接种,然后取叶片分别提取获得两组总蛋白。用纯化后的蛋白GST-PID3^CC-NBS分别与两组总蛋白共培养后,利用GST pull-down技术获得了分别在抗病、感病反应中能与PID3^CC-NBS互作的两组候选蛋白。通过质谱技术鉴定这些蛋白的氨基酸序列,比对分析其在抗病、感病途径中与PID3结合的差异性,我们共筛选出31个只在PID3介导的抗稻瘟病反应中能与其特异结合的PID3互作蛋白,这些互作蛋白包括受体激酶、LRR类蛋白、ATP酶、磷酸羧化酶和离子通道蛋白等,广泛参与了调控细胞程序化死亡、胁迫防御反应、物质与能量代谢和信号传导等多个生物学过程。本研究探寻了PID3介导的抗病信号转导过程的关键因子,研究结果为揭示PID3介导的稻瘟病抗病分子机理奠定了良好基础。