020 Évaluation expérimentale de la viabilité endothéliale cornéenne par triple marquage Hoechst 33342, éthidium homodimère et calcéine-AM (HEC) : améliorations techniques par microscopie 3D

Introduction Une quantification fiable de la viabilite endotheliale est primordiale dans l’evaluation experimentale de toute nouvelle procedure (nouveaux milieux ou procedes de conservation) susceptible de modifier l’endothelium corneen. La mesure de la densite cellulaire endotheliale (DCE) seule ne renseigne pas sur la viabilite et la coloration vitale au bleu trypan sous-estime largement la mortalite. Le double marquage par calceine-AM (C) et ethidium homodimere (E) permet classiquement de reperer (1) les cellules viables dont les esterases non specifiques transforment la calceine en un substrat vert fluorescent et (2) les cellules mortes dont la membrane permeable laisse entrer l’ethidium qui colore les noyaux en rouge. But : presenter des ameliorations de cette coloration combinee au marquage nucleaire par Hoechst 33342 (H) par l’utilisation d’un microscope fluorescent 3D applique a l’evaluation experimentale de l’endothelium de cornees humaines entieres. Materiels et Methodes La face endotheliale etait incubee 45 min a 31°C avec 100 μL de C (2 μm), E (5 μm), H (10 μm). Apres montage a plat, pour chaque marqueur, les images de la totalite de la surface endotheliale (81 mm 2 ) etaient acquises par microscope IX81, a l’objectif ×4, par platine motorisee XY. Pour chaque position, une pile d’image en Z permettait de recuperer les differences de niveaux dues aux plis endotheliaux. La DCE etait mesuree par comptage automatique des noyaux H +, la mortalite par le rapport E +/H +. Les cellules H +/E-/C-, considerees comme non encore mortes mais metaboliquement inactives etaient denombrees a part. Resultats Le triple marquage HEC sur la totalite de la surface endotheliale et en 3D permettait une mesure fiable et rapide de la viabilite de la totalite de l’endothelium corneen, donnant acces a la DCE, au taux de mortalite et a une evaluation de l’activite metabolique. Discussion Le triple marquage HEC permet de mesurer objectivement les lesions endotheliales a un instant donne et de prendre en compte l’heterogeneite de repartition des lesions endotheliales. Conclusion Son utilisation ameliore et fiabilise l’evaluation experimentale de tout nouveau procede susceptible de modifier l’endothelium corneen ex vivo .