Técnicas instrumentales y computacionales para la caracterización de sistemas de macromoléculas y nanopartículas : implementación y aplicaciones

espanolOBJETIVOS Las nanoparticulas metalicas han despertado gran interes en la comunidad cientifica, debido a las propiedades que presentan, dotandolas de gran utilidad en industria y biomedicina. Por todo ello, gran parte de esta Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio y caracterizacion de estos sistemas utilizando distintos procedimientos para sintetizar y caracterizar las propiedades de estructuras de nanoparticulas recubiertas con polimero. Asi mismo, se han estudiado el comportamiento y la estructura de diversas macromoleculas (proteinas, polimeros y fluidos biologicos y sinteticos) mediante las tecnicas instrumentales presentes en nuestro laboratorio, las cuales se han puesto a punto previamente. Alguno de los estudios experimentales que se han llevado a cabo han sido complementados, con estudios computacionales mediante la utilizacion de programas desarrollados por nuestro grupo de investigacion. Asi, mediante las tecnicas experimentales de dispersion de luz dinamica, ultracentrifugacion analitica o reometria y programas computacionales como HYDRO, hemos sido capaces de caracterizar macromoleculas y conocer sus propiedades hidrodinamicas. Por lo tanto, los objetivos que se fijaron antes de comenzar esta Tesis Doctoral fueron los siguientes: 1. Sintesis de nanoparticulas de oro mediante procedimientos habituales de obtencion y recubrimiento de estas con polimeros biologicos y sinteticos. 2. Estudio y caracterizacion de macromoleculas, mediante tecnicas de ultracentrifugacion analitica, reometria y viscosimetria. 3. Estudio teorico de las diferentes macromoleculas sinteticas y biologicas estudiadas experimentalmente, mediante el uso de programas computacionales desarrollados por nuestro grupo de investigacion. METODOLOGIA La metodologia que se ha empleado durante esta Tesis Doctoral tiene dos aspectos totalmente diferenciados; por un lado, se han desarrollado metodos experimentales mediante las tecnicas disponibles en nuestro laboratorio y en los servicios de apoyo a la investigacion de la Universidad de Murcia: Dispersion de luz dinamica, espectroscopia visible-ultravioleta y microscopia de transmision electronica para la caracterizacion de las nanoparticulas sintetizadas; ultracentrifugacion para el estudio de diversas proteinas y polimeros y reometria para el estudio del comportamiento de diferentes fluidos tanto biologicos como sinteticos. Y por otro lado, se han utilizado metodos teoricos y computacionales mediante programas complejos de calculo y simulacion, tales como Hydropro, Visfit, Polycarlo y Simuflex para el estudio de propiedades hidrodinamicas de macromoleculas. Tambien se ha desarrollado un programa durante esta Tesis Doctoral, Rheofit, que nos ha servido para el analisis de resultados experimentales obtenidos en nuestra investigacion. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han sido satisfactorios debido a que se han cumplido los objetivos fijados. Ademas, gran parte de estos resultados, han formado parte de publicaciones. A continuacion, se describen las conclusiones mas importantes de esta Tesis Doctoral: 1. Las tecnicas instrumentales aplicadas en la elaboracion de esta Tesis Doctoral han resultado ser de gran utilidad para el analisis y caracterizacion de los diferentes sistemas macromoleculares y nanoparticulas que se han estudiado. Entre ellas, la reometria nos permitio conocer el valor de la viscosidad de fluidos biologicos y de fluidos artificiales con gran interes para la reproduccion, la viscosimetria nos permitio conocer el poder intercalante de complejos organometalicos de platino sintetizados, debido a la variacion de la viscosidad en funcion del mecanismo de union de estos complejos con el ADN, con la tecnica de ultracentrifugacion analitica, pudimos conocer el estado de oligomerizacion de una enzima procariota y la dispersion de luz dinamica nos permitio demostrar que los picos de corriente obtenidos en un proceso electroquimico corresponden a colisiones individuales de gotas de la emulsion con la interfase. 2. En el estudio de nanoparticulas de oro, se pudo comprobar que la estabilidad de las nanoparticulas disminuye dependiendo de las condiciones del medio en el que se encuentren, dando lugar a la agregacion de estas. Sin embargo, en presencia de quitosano, dichas nanoparticulas se aproximan por atraccion electroestatica a los agregados formados por este, evitando asi la agregacion de nanoparticulas. 3. Se caracterizo el PNIPAAM-b-PAMPTMA(+), un polimero termosensible modificado, ya que su carga positiva lo hace de gran interes para el recubrimiento de nanoparticulas de oro. Se realizaron unas primeras medidas del polimero con nanoparticulas de oro, observandose buenos resultados que nos lleva a continuar con esta investigacion. 4. En el estudio de la union entre nanoparticulas de oro y ADN, se concluyo que la ultracentrifugacion analitica es un metodo adecuado para la caracterizacion de mezclas complejas de productos de reaccion. Esta tecnica unida a los programas de modelado creados por nuestro grupo de investigacion, nos permitio conocer de una manera mas exacta la conformacion de estos compuestos. EnglishOBJECTIVES Metal nanoparticles have aroused great interest in the scientific community, due to their properties, making them very useful in industry and biomedicine. Therefore, much of this Thesis has focused on the study and characterization of these systems using different procedures to synthesize and characterize the properties of nanoparticle structures coated with polymer. Likewise, the behavior and structure of various macromolecules (proteins, polymers and biological and synthetic fluids) have been studied through the instrumental techniques present in our laboratory, which have been previously developed. Some of these experimental studies have been complemented with computational studies through the use of programs developed by our research group. Thus, through the experimental techniques of dynamic light scattering, analytical ultracentrifugation or rheometry and computational programs like HYDRO, we have been able to characterize macromolecules and to know their hydrodynamic properties. Therefore, the objectives that were set before starting this Doctoral Thesis were the following: 1. Synthesis of gold nanoparticles by usual methods of obtaining and coating these with biological and synthetic polymers. 2. Study and characterization of macromolecules by means of analytical ultracentrifugation, rheometry and viscosimetry techniques. 3. Theoretical study of the different synthetic and biological macromolecules studied experimentally, through the use of computer programs developed by our research group. METHODOLOGY The methodology that has been used during this Doctoral Thesis has two totally different aspects; on the one hand, experimental methods have been developed using the techniques available in our laboratory and the research support services of the University of Murcia: Dynamic light scattering, visible-ultraviolet spectroscopy and electron transmission microscopy for the characterization of synthesized nanoparticles; ultracentrifugation for the study of various proteins and polymers and rheometry for the study of the behavior of different biological and synthetic fluids. On the other hand, theoretical and computational methods have been used through complex calculation and simulation programs such as Hydropro, Visfit, Polycarlo and Simuflex for the study of hydrodynamic properties of macromolecules. We have also developed a program during this Doctoral Thesis, Rheofit, which has served us for the analysis of experimental results obtained in our research. CONCLUSIONS The results obtained in this Doctoral Thesis have been satisfactory due to the fulfillment of the objectives set. In addition, much of these results have been part of publications. The following are the most important conclusions of this Doctoral Thesis: 1. The techniques applied in the elaboration of this Doctoral Thesis have proved to be very useful for the analysis and characterization of the different macromolecular systems and nanoparticles that have been studied. Among them, the rheometry allowed us to know the value of the viscosity of biological fluids and artificial fluids with great interest for the reproduction, the viscosimetry allowed us to know the intercalating power of synthesized platinum organometallic complexes, due to the variation of the viscosity in the function of the binding mechanism of these complexes with DNA, with the technique of analytical ultracentrifugation, we were able to know the state of oligomerization of a prokaryotic enzyme and the dynamic light scattering allowed us to demonstrate that the current peaks obtained in an electrochemical process correspond to individual collisions of droplets of the emulsion with the interface. 2. In the study of gold nanoparticles, it was possible to verify that the stability of the nanoparticles decreases depending on the conditions of the medium in which they are found, giving rise to the aggregation of these. However, in the presence of chitosan, said nanoparticles are approximated by electrostatic attraction to the aggregates formed by it, thus avoiding the aggregation of nanoparticles. 3. We characterized PNIPAAM-b-PAMPTMA (+), a modified thermosensitive polymer, since its positive charge makes it of great interest for the coating of gold nanoparticles. First measurements of the polymer were made with gold nanoparticles, observing good results that leads us to continue this research. 4. In the study of the connection between gold nanoparticles and DNA, it was concluded that analytical ultracentrifugation is a suitable method for the characterization of complex mixtures of reaction products. This technique, together with the modeling programs created by our research group, allowed us to know more precisely the conformation of these compounds.