КЛАСТЕР ГЕНОВ THERMOTOGA NEAPOLITANA, УЧАСТВУЮЩИХ В ДЕГРАДАЦИИ КРАХМАЛА И МАЛЬТОДЕКСТРИНОВ: ЭКСПРЕССИЯГЕНОВ AGLB И AGLA В ESCHERICHIA COLI, СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ

В работе субклонировали гены aglB и aglA из кластера генов утилизации крахмала и мальтодекстринов Thermotoga neapolitana в векторах pQE для экспрессии в клетках Escherichia coli. Рекомбинантные белки AglB и AglA очищены практически до гомогенности и охарактеризованы. Оба фермента гипертермостабильны, оптимальная температура активности - 85°С. AglB представляет собой олигомерный белок, состоящий из идентичных субъединиц с мол. массой 55 кДа, склонных к агрегации. Он гидролизует циклодекстрины и линейные мальтодекстрины до глюкозы и мальтозы, отщепляя глюкозу с редуцирующего конца молекул, и является циклодекстриназой с α-глюкозидазной активностью. Мощный ингибитор α-амилаз и α-глюкозидаз - акарбоза - не ингибирует AglB, а, напротив, полностью гидролизуется ферментом. Рекомбинантный AglB активируется в присутствии CaCl 2, KCl и EDTA, а также после прогрева фермента. Рекомбинантный AglA представляет собой димер, состоящий из двух идентичных субъединиц с мол. массой 54 кДа. Он гидролизует α-гликозидные связи дисахаридов и коротких мальтоолигосахаридов, действуя на субстрат с нередуцирующего конца цепи. Это кофактор-зависимая α-глюкозидаза широкого спектра действия, гидролизующая как олигоглюкозиды, так и галактозиды с α-связями, т.е. фермент не специфичен по отношению к конфигурации углерода в позиции 4. Для активности фермента необходимо присутствие NAD +, DTT и Mn 2+. Ферменты AglB и AglA дополняют друг друга по субстратной специфичности, обеспечивая полный гидролиз до глюкозы промежуточных продуктов, образующихся в процессе деградации крахмала.