Aislamiento y caracterización de antígenos de E. histolytica inductores de producción de óxido nítrico en fagocitos humanos

La amibiasis es una enfermedad producida por el protozoario parasito Entamoeba histolytica. Estudios in vitro han demostrado que la actividad amebicida de macrofagos activados depende principalmente de la sintesis inducible de oxido nitrico (NO). Varios antigenos han sido probados como vacunas en modelos animales. Sin embargo, aun no se ha demostrado que alguno de estos sea capaz de inducir una respuesta inmune protectora en seres humanos. Nosotros propusimos como alternativa aislar y caracterizar antigenos de E. histolytica capaces de activar fagocitos humanos (FgH) con produccion de NO y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). Se determino la produccion de nitritos, en co-cultivos de monocitos y linfocitos humanos provenientes de sangre periferica, en las lineas monociticas humanas THP1 y U937, y en celulas totales de sangre periferica estimuladas con lipopolisacaridos (LPS). No se encontraron diferencias significativas en la produccion de nitritos entre las celulas no estimuladas y los grupos experimentales (P > 0.05). Las diferencias significativas se observaron en la linea de macrofagos murinos J774 (P < 0.05). Sin embargo, al estimular celulas totales de sangre periferica durante 5 h con LPS y determinar la produccion total de NO en plasma, mediante la reduccion de nitratos a nitritos, se obtuvieron los mejores resultados (P < 0.05). Este modelo se utilizo para evaluar la respuesta de los FgH frente a los antigenos amibianos obtenidos. La produccion de NO en FgH estimulados con antigeno total amibiano (ATA) y con fracciones amibianas obtenidas mediante HPLC, fue dosis-dependiente. Las fracciones que indujeron la mayor produccion de NO fueron la fraccion F6 y F7, produciendo 25 ± 2 y 23.31 ± 2 µM, respectivamente, a una concentracion de 500 ng/mL. Por otro lado, las celulas estimuladas con ATA y con la fraccion F7 produjeron 65.2 pg/mL y 9.6 pg/mL de TNF-α, respectivamente. En ambos casos las diferencias fueron significativas con respecto a las celulas no estimuladas (P < 0.05). Nuestros resultados e investigaciones previas mostraron que existen numerosas limitaciones en modelos disenados para determinar produccion de NO en fagocitos humanos. Las principales son estimulacion inadecuada, inhibicion transcripcional, enzima sintasa inducible del oxido nitrico (iNOS) no funcional, y falta de sustrato y de cofactores indispensables. Considerando que el TNF-α aumenta la citotoxicidad dependiente de NO de los macrofagos contra E. histolytica, nosotros proponemos que los antigenos aislados en el presente proyecto son excelentes inmunogenos y por tanto, candidatos para desarrollar una vacuna; porque contribuyen al desarrollo de los mecanismos efectores celulares mas efectivos en la defensa del hospedero contra este parasito. Abstract Amoebiasis is a disease produced by the protozoan parasite Entamoeba histolytica. In vitro studies have demonstrated that the amebicidal activity of activated macrophages mainly depends on the inducible synthesis of nitric oxide (NO). Several antigens have been proved as vaccines in animal models. Nevertheless, none of these has demonstrated to induce any immune protective response in human beings. As an alternative, we have proposed to isolate and characterize antigens of E. histolytica capable of activate human phagocytes (HFg) with NO and tumor necrosis factor alfa (TNF-α) production. The nitrite production was determinated in human peripheral co-cultures of monocytes and lymphocytes, THP-1 and U937 human monocyte cell lines and whole peripheral human blood cells. All of them were stimulated with lypopolysaccharide (LPS). No significant differences in nitrite production were observed between non-stimulated cells and that of the experimental groups (P> 0.05). An important production of NO was observed when J774 murine macrophages (P <0.05) were used; but the best results were obtained using whole peripheral human blood cells during 5 h in the presence of LPS. In these model NO production was determinated in plasma, using the Griess method by means of the reduction of nitrates to nitrites. Thus, this latter model was used to evaluate the response of the HFg primed with the amebic antigens. NO production by HFg primed with total amebic antigen (ATA) and with the amebic fractions obtained with HPLC was dose-dependant. F6 and F7 fractions induced the highest NO production (25 ± 2 and 23.31 ± 2 µM, respectively) wih an antigen concentration of 500 ng/mL. On the other hand, the cells stimulated with ATA and the F7 fraction produced 65.2 pg/mL and 9.6 pg/mL of TNF-α, respectively. In both cases the differences were significative comparing with non stimulated cells (P < 0.05). Our results, in agreement with those of other workers, showed that numerous limitations exist to determine NO production in human phagocytes. The main of these are an inadequate stimulation, transcriptional inhibition, not functional inducible nitric oxide synthase (iNOS), and lacking of substrate and specific cofactors. Considering that TNF-α increases NO-dependent macrophage citotoxicity against E. histolytica and that they contribute to develop effective cellular effector mechanisms in the defense against this parasite, we are proposing that the antigens isolated from E. histolytica trophozoites in the present study are excellent immunogens, and therefore, these are idoneous candidates to develop an anti-E. histolytica vaccine.