Structure and Dynamics of Intramembrane Protease Substrates by NMR Spectroscopy

In dieser Arbeit wurden die Substrate zweier Intramembranproteasen untersucht. Beim ersten Substrat handelte es sich um die Transmembrandomane des Amyloid Precursor Protein (APP), ein Substrat der γ-Sekretase. Es ist im Zusammenhang mit Morbus Alzheimer bekannt. Das zweite Substrat war die Transmembrandomane der Serin/Threonin-Protein Phosphatase PGAM5, die von PARL prozessiert und mit Morbus Parkinson in Verbindung gebracht wird. Intramembranproteasen, die an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt sind, schneiden ihre Substrate in der Ebene der Membran. Bisher wurden die Spaltungsprozesse selbst noch nicht auf struktureller Ebene untersucht, aber man geht davon aus, dass die Struktur und die Dynamik ihrer Substrate von entscheidender Bedeutung sind. Im Gegensatz zu loslichen Proteasen wird in Intramembranproteasen keine Konsensussequenz erkannt, trotzdem reagieren sie empfindlich auf Punktmutationen in der Substratsequenz. APP, das erste untersuchte Substrat, wird von der γ-Sekretase zunachst an der e- Schnittstelle geschnitten und dann in mehreren Schritten weiter verkurzt, bis ein kurzes Fragment entsteht, das Aβ genannt wird. Dabei sind verschiedene Prozessierungswege moglich, die zu unterschiedlichen Produkten fuhren. Die zwei Hauptprodukte sind Aβ40 und Aβ42, wobei letzteres die im Zusammenhang mit Morbus Alzheimer bekannten Amyloid-Plaques im Gehirn bildet. Bei den beiden in dieser Arbeit untersuchten FAD Mutationen wurde festgestellt, dass der Anteil von Aβ42 im Vergleich zu Aβ40 zunimmt. Da beide Mutationen bei Patienten mit erblichem Morbus Alzheimer gefunden wurden, wird die Veranderung dieses Gleichgewichts als einer der Grunde fur die fruh einsetzende und schnell zum Tod fuhrende Krankheit vermutet. Mit hochaufgeloster Kernresonanzspektroskopie wurden der Wildtyp der APP Transmembrandomane sowie vier Punktmutationen intensiv untersucht. Dabei handelte es sich einerseits um die zwei FAD Mutanten nahe der e-Schnittstelle (V44M und I45T), andererseits um zwei Mutationen am zentralen G37G38-Motiv. Eine Prolinmutante (G38P) wurde eingefuhrt, um die Transmembrandomane an dieser Stelle zu destabilisieren. Zur Stabilisierung wurde das gleiche Glycin gegen Leucin (G38L) ausgetauscht. Es wurden verschiedene NMR Spektren aufgenommen, aus denen Strukturparameter abgeleitet werden konnten. Zum einen waren dies sekundare chemische Verschiebungen, die die Sekundarstruktur beschreiben. Zum anderen konnten dreidimensionale Strukturen auf Basis der NMR Daten errechnet werden. Zusatzlich wurde der Wasserstoff-Deuterium Austausch gemessen, der Ruckschlusse auf die Stabilitat von Wasserstoffbrucken zulasst. Die Analysen wurden in TFE/H2O durchgefuhrt, da das aktive Zentrum des Enzyms mit Wasser gefullt ist. TFE/H2O ist deshalb besonders gut geeignet, um die Bedingungen im Inneren des Enzyms abzubilden. Die vier Mutanten unterscheiden sich in ihrer Struktur kaum vom Wildtyp. An der e-Schnittstelle waren keine Unterschiede zu erkennen, die die unterschiedliche Spaltung erklaren konnten. Auffallig war, dass es sich zwar in allen Fallen um durchgehende α-Helices handelte, diese aber aus zwei Bereichen bestanden. Dabei bildete das G37G38-Motiv eine Art Scharnier zwischen beiden Abschnitten, sodass die Gesamtstruktur nicht gerade, sondern geknickt war. Der Winkel zwischen den beiden Segmenten war dabei auf einen bestimmten Bereich beschrankt. Auch die relative Orientierung, also die Richtung des Knicks, war eingeschrankt. Sowohl die Starke des Knicks, als auch die Vorzugsrichtungen wurden von jeder Mutation anders beeinflusst. Auf der Grundlage von MD-Simulationen von M. Hitzenberger wurde daraufhin postuliert, dass das Substrat an diesem G37G38-Scharnier knicken muss, um das aktive Zentrum der γ-Sekretase erreichen zu konnen. Hitzenberger hatte den initialen Komplex von Enzymen und Substrat untersucht. Die NMR Strukturen des APP TMD Wildtyp passten gut zu diesem Modell, wohingegen die Strukturen der Mutanten mit den TMDs der γ-Sekretase kollidierten. Fur PARL, eine Rhomboid Protease, wird angenommen, dass es Substrate ebenfalls anhand ihrer Struktur und Dynamik erkennt, da hier ebenfalls keine Konsensussequenz erkannt wird. Die Transmembrandomane des PARL Substrats PGAM5 WT und vier Punktmutationen wurden ebenfalls mittels NMR untersucht. Im Falle von PGAM5 wurden drei Reste mutiert, die zwischen verschiedenen Organismen konserviert sind, da angenommen wurde, dass diese eine essentielle Funktion erfullen. Alle drei Aminosauren wurden gegen Leucin ausgetauscht (C12L, G17L, G18L). Als vierte Mutation wurde eine Serin-Mutante untersucht (C12S). Auch hier wurden verschiedene sekundare chemische Verschiebungen ermittelt und die dreidimensionalen Strukturen berechnet. Zusatzlich wurde ebenfalls der Wasserstoff- Deuterium Austausch gemessen. Dabei zeigte sich, dass die TMD von PGAM5 genauso wie die von APP aus zwei helikalen Bereichen bestand. Bei PGAM5 waren diese allerdings durch einen unstrukturierten Bereich verbunden. Deshalb ergab sich aus dem Vergleich der funf Peptide, anders als bei APP, keine klar definierte Vorzugsrichtung. Allerdings waren Praferenzen zu erkennen. Mittels Rontgenstrukturanalyse war fur ein anderes Rhomboid, GlpG gezeigt worden, dass der Bereich um die Schnittstelle hoch dynamisch sein muss, sobald er die Membran verlasst. Das in der Literatur postulierte Modell geht davon aus, dass sich der entsprechende Bereich der Helix vollstandig entwinden muss, bevor er ins aktive Zentrum gelangen kann. Die berechneten Strukturen von PGAM5 lassen vermuten, dass in diesem Falle ein ahnlicher Mechanismus zugrunde liegt. Zusammenfassend lasst sich sagen, dass die Transmembrandomanen sowohl von APP als Substrat der γ-Sekretase als auch von PGAM5 aus zwei Segmenten bestanden. Im Falle von APP TMD war deren relative Anordnung vergleichsweise stark eingeschrankt, wahrend sich fur PGAM5 hingegen keine klare Praferenz ergab. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte anhand der NMR Daten eine Hypothese fur Substrate der γ-Sekretase formuliert werden: Nur die Struktur des kann in die von der MD Simulation vorgegebene Richtung abknicken, wohingegen die Strukturen der vier Mutanten gedreht werden mussen, um mit dem Enzym interagieren zu konnen. Diese Drehung konnte dann dazu fuhren, dass das Substrat anders prozessiert wird.