Stratégie de production d’anticorps monoclonaux spécifiques de Ly49B, un récepteur particulier des cellules NK murines.

Les cellules NK de souris peuvent exprimer une variete de recepteurs dont la majorite appartiennent a la famille Ly49 qui contient des recepteurs d'activation et des recepteurs d'inhibition. Le recepteur Ly49B, ayant un ITIM (lmmunoreceptor Tyrosine-based lnhibitory Motif) dans sa portion cytoplasmique, il a le potentiel d'etre un recepteur d'inhibition. Toutefois, sa fonction n'a toujours pas ete demontree. Au plan structural, il est le recepteur le plus different des autres membres de la famille Ly49. Exploitant cette particularite, nous avions comme objectif de produire un anticorps monoclonal specifique de ce recepteur afin de pouvoir l'utiliser pour determiner son expression sur differentes cellules notamment les cellules NK, LAK et NKT dans differents tissus de differentes souches de souris, pour analyser la modulation de son expression selon l'haplotype H-2 et finalement pour confirmer sa capacite a inhiber la cytotoxicite des cellules NK. Tout d'abord, 9 rats ont ete immunises avec des cellules LAK de souris. Apres avoir analyse les serums immuns, 4 rats ont ete choisis pour faire des fusions entre les cellules spleniques et des cellules myelomateuses de souris. Lors de ces 4 fusions, 1550 surnageants d'hybridomes ont ete analyses en ELISA pour la presence d'anticorps specifiques de sequences uniques du recepteur Ly49B inserees dans des phages filamenteux. 57% des hybridomes secretaient des lg, mais aucune de celles-ci ne reagissait avec le recepteur Ly49B. Afin de diminuer la competition antigenique attribuable aux autres proteines de surface des cellules LAK, nous avons tente de produire le domaine extracellulaire du recepteur Ly49B soluble en utilisant un systeme d'expression de proteine dans les levures Pichia pastoris. De nombreuses difficultes sont survenues lors des transformations et seulement 90 transformants ont pu etre analyses. Malheureusement, aucun de ceux-ci ne secretait une forme stable du domaine extracellulaire du recepteur Ly49B. Finalement, nous avons transfecte des cellules humaine Jurkat T J77.6 avec l'ADNe du Ly49b insere dans le vecteur d'expression eucaryote SRapuro. Cinq rats ont ete immunises avec ces cellules. Apres avoir analyse les serums pour nous assurer que les animaux avaient reagi a l'immunogene, les fusions ont ete effectuees. Lors des 4 premieres fusions, 341 surnageants d'hybridomes ont ete analyses par cytometrie en flux pour la presence d'lg specifiques du recepteur Ly49B. Toutefois, etant donne que seulement 10% des hybridomes produisaient des lg, il n'est pas surprenant qu'aucun de ceux-ci n'ait reconnu le recepteur Ly49B. La dose administree au dernier rat a ete augmentee. Un hybridome produisant un anticorps se liant selectivement aux cellules transfectees avec l'ADNe du recepteur Ly49B a ainsi pu etre identifie. Toutefois, malgre que nous ayons atteint cet objectif, le temps alloue pour mes etudes de maitrise ne m'a pas permis de poursuivre sa caracterisation. En resume, l'echec des fusions avec les cellules spleniques des animaux immunises avec des cellules LAK est probablement attribuable au faible niveau d'expression du recepteur Ly49B sur ces cellules. L'immunisation d'animaux avec la portion extracellulaire soluble de la proteine aurait ete la meilleure alternative, mais nous ne sommes malheureusement pas parvenus a la produire. Finalement, l'immunisation des rats avec une forte dose de cellules transfectees a porte fruit. Des analyses futures nous permettront de confirmer la specificite de l'anticorps et d'enfin poursuivre la caracterisation de ce recepteur particulier.