Molecular mechanism of draxin signaling in axonal guidance

Wahrend der neuronalen Entwicklung reagieren Axone auf eine Bandbreite an Signalen um zu ihren Zielen zu gelangen. Wachstumskegel an der Spitze der Axone wahlen ihren Pfad mit Hilfe von extrazellularen Signalen den Steuerungssignalen. Diese bestehen aus fingerahnlichen Ausbuchtungen, Filopodien und schleierartigen Strukturen, die als Lamellopodien bezeichnet werden. Signale konnen Wachstumskegel entweder anziehen oder abstosen. Extrazellulare Signale sind Molekule die von Zellen entlang des axonalen Weges segregiert werden oder auf der Zelloberflache prasentiert werden. Sie beinhalten Netrin, Semaphorine und Ephrine. Diese Steuerungssignale regulieren das Vorandringen der Wachstumskegel sowie Richtung und Verzweigung wahrend Neuausrichtungen des Zytoskeletts. Die Dynamik von Wachstumskegeln wird durch zwei Komponenten des Zytoskeletts reguliert, Aktin und Mikrotubuli. Mikrotubuli sind extrem dynamische Strukturen, involviert in Neuritenextension, -repulsion und -polaritat. Die Dynamik von Mikrotubuli wird reguliert durch MAP1Bs (microtubule associated protein 1B), eine Klasse von Proteinen die entlang der Mikrotubuli binden und deren Funktion in Wachstum und Steuerung regulieren. MAP1B knockout (KO) Mause zeigen verschiedene Defekte, unter anderem Agenesie des Corpus Callosum und fehlgeleitete Kommissuren welche Probst-Bundel bilden. Seit kurzem ist das Steuerungssignal Draxin als ein wichtiges repulsives Axon-Steuerungssignal bekannt. Es ist essentiell fur die Bildung von Kommissuren des Ruckenmarks und des Vorderhirns; eingeschlossen das Corpus Callosum. Draxin wird in verschiedenen Hirnregionen exprimiert: Cortex, Riechkolben, Mittelhirn und Cerebellum. Es inhibiert das Herauswachsen von Neuriten aus dem dorsalen Ruckenmark, Riechkolben und corticalen Explantaten in vitro. Draxin vermittelt die Inhibition durch verschiedene Rezeptoren: DCC (deleted in colorectal cancer), Neogenin, UNC5s (H1, H2, H3) und DSCAM (Down’s syndrome cell adhesion molecule). Die molekularen Details der Draxin Wirkungsweise sind unbekannt. Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich untersucht wie MAP1B in Draxin und Semaphorin3A (Sema3A) induzierter Inhibition des Neuritenauswuches sowie dem Zusammenbruch von Wachstumskegeln involviert ist. Zur Beantwortung dieser Fragen habe ich zwei Versuchsansatze etabliert. Zur Untersuchung des Neuritenauswuchses wurden zerebrale kortikale Explantate verwendet. Der Zusammenbruch von Wachstumskegeln wurde mittels dissoziierter kortikaler Neuronen untersucht. Die Versuche deuteten darauf hin das Draxin und Sema3A Signalwege von MAP1B abhangen. Mit Hilfe von genetischen und pharmakologischen Experimenten habe ich herausgefunden das Draxin induzierter Zusammenbruch von Wachstumskegeln stark von Draxinrezeptoren abhangt (DCC), sowie abhangig ist von der Proteinkinase Akt und Aktivierung von GSK-3β (Glykogen Synthase Kinase-3 β). Diese wiederum korreliert mit erhohter Phosphorylierung von MAP1B. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal die molekularen Mechanismen welche der Draxin Repulsion zugrunde liegen. Sie stellt den Zusammenhang her zwischen Draxin und DCC mit MAP1B und beinhaltet die Identifizierung eines neuen GSK-3β Signalweges, welcher essentiell ist fur repulsive Axonsteuerung. Zusatzlich habe ich den Effekt von Draxin auf die Polarisierung von dissoziierten kortikalen Neuronen und den Effekt von Sema3A auf die Verzweigung von pyramidalen Neuronen untersucht. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich mir die Rolle von Myosin in Stickoxid-induzierter Axon Repulsion in Mausneuroblastomazelllinien (N2a) angeschaut. Mysosin ist ein Motor Protein welches in die Aktin-Mysosin Kontraktion involviert ist. Unter Verwendung von biochemischen Versuchen habe ich die Mono-Phosphorylierung der MRLC (myosin regulatory light chain) an Serin 19 als Indikator fur Myosin Aktivitat angesehen. N2a Zellen wurden mit SNAP, einem Stickoxid (NO) Donor, behandelt. Der Anstieg der Phosphorylierung wurde partiell inhibiert durch den ROCK Inhibitor Y27632. ROCK ist eine Rho-assozierte Kinase. Das Ergebnis deutet darauf hin das ROCK eine Schlusselrolle zukommt in Myosinaktivierung als Reaktion auf die SNAP Behandlung. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse das Myosin wichtig ist fur die Axon Repulsion induziert durch NO.