CLONAGEM, PURIFICAçãO E CARACTERIZAçãO DO ANTÍGENO RECOMBINATE P42 DE Mycoplasma hyopneumoniae

CLONAGEM, PURIFICACAO E CARACTERIZACAO DO ANTIGENO RECOMBINATE P42 DE Mycoplasma hyopneumoniae  OLIVEIRA, Natasha R1 *; JORGE, Sergio1; GOMES, Charles K1, FISCH, Andressa1; CONCEICAO, Fabricio R2; DELLAGOSTIN, Odir A1 1Laboratorio  de Vacinologia, 2Laboratorio de Imunologia Aplicada, Centro de Desenvolvimento Tecnologico (CDTec), Nucleo de Biotecnologia,Universidade Federal de Pelotas – Pelotas - RS*endereco eletronico para correspondencia: oliveira_natasha@hotmail.com  1 INTRODUCAO      Mycoplasma hyopneumoniae e o agente etiologico da Pneumonia Enzootica Suina (PES), doenca respiratoria contagiosa que acomete suinos em producao em todo o mundo. As vacinas comerciais (bacterinas) existentes fornecem apenas uma protecao parcial contra a enfermidade. Neste trabalho, foi eficientemente clonada e expressa a proteina MHP0067 em um sistema heterologo, visando sua utilizacao em ensaios vacinas contra a PES. 2 OBJETIVOS      Este trabalho teve por objetivo clonar, expressar, purificar e caracterizar a chaperona DnaK  P42 (proteina de choque termico), visando o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a PES. 3 METODOLOGIA     A sequencia codificadora do antigeno P42 foi amplificada por PCR, utilizando DNA extraido de M. hyopneumoniae cepa 7448 como molde. O gene resultante foi clonado no vetor pAE, utilizando E. coli TOP 10. Os clones recombinantes foram selecionados e propagados em caldo LB contendo 100 μg/mL de ampicilina.  A presenca do inserto foi confirmada por PCR e digestao com as enzimas de restricao BamHI e KpnI, cujos sitios foram inseridos flanqueando o gene.   O vetor pAE/P42 foi transformado por choque termico em E. coli Star e esta foi inoculada em meio LB contento ampicilina (37o, 250 rpm) ate atingir a fase log de crescimento. A expressao da proteina foi induzida por IPTG 1 M. Apos centrifugacao do cultivo, o pellet foi suspenso em PBS 1X, sonicado e lavado. Apos, o pellet foi solubilizado com 0,2% de N-Lauroylsarcosine. O material foi centrifugado e o sobrenadante foi filtrado. A proteina foi purificada por cromatografia de afinidade utilizando Sepharose (HisTrap) carregada com niquel.  4 RESULTADOS A eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) confirmou a expressao da proteina de 42 kDa em E. coli Star clonada no vetor pAE.      A proteina obtida foi avaliada por Western blot onde foram utilizados soro policlonal anti-P42 e soro monoclonal anti-histidina evidenciando que a mesma manteve sua antigenicidade.5 DISCUSSAO    A expressao e caracterizacao do antigeno MHP0067 (P42) e um importante passo para o desenvolvimento de uma vacina recombinante eficiente e de baixo custo contra a PES. A partir da analise dos resultados obtidos, conclui-se que os protocolos moleculares e imunologicos realizados para clonagem, expressao, purificacao e caracterizacao da proteina P42 foram efetivos. A proteina sera expressa em grande escala para a utilizacao em ensaios vacinas na especie-alvo. 6 CONCLUSAO     Este trabalho permite concluir que a expressao do antigeno MHP0067 e efetiva em sistema heterologo. A proteina purificada tera seu potencial imunogenico testado e avaliado em suinos naturalmente desafiados por M. hyopneumoniae objetivando desenvolver uma vacina recombinante que promova uma resposta imune protetora contra a PES.