Interactions between titanium surfaces and biological components

El conocimiento de las interacciones entre celula/proteina/biomaterial es fundamental para la ingenieria de superficies debido a las numerosas aplicaciones biomedicas y biotecnologicas que se estan desarrollando asi como al exito clinico que han alcanzado muchos implantes. La respuesta biologica final inducida por los implantes esta fuertemente influenciada por las interacciones superficiales entre los componentes biologicos y el material sintetico. Las propiedades fisicas y quimicas de la superficie de un biomaterial, en lugar de las propiedades en su masa, influyen directamente en la capa de proteinas que se adsorben sobre el biomaterial y, como consecuencia de ello, en la respuesta celular a la misma, tanto in vitro como in vivo. El objetivo de esta tesis doctoral es profundizar en el conocimiento de las interacciones material-biosistema, con el enfasis en el descubrimiento de relaciones entre las propiedades superficiales de las superficies de titanio y su respuesta biologica in vitro. El titanio comercialmente puro (Ti c.p.) esta siendo ampliamente utilizado con exito durante muchos anos como biomaterial para implantes en cirugia osea. Su excelente biocompatibilidad se basa en sus adecuadas propiedades mecanicas y, con mayor importancia, en su excelente resistencia a la corrosion. Esta ultima se debe principalmente a la formacion espontanea de una fina pelicula de oxido de titanio que le confiere proteccion natural contra los ataques degradativos. La modificacion de la topografia de la superficie del titanio ha sido objeto de investigacion en el pasado con el fin de mejorar la osteointegracion. El granallado de particulas es una de las tecnologias mas utilizadas para conferir rugosidad a las superficies del titanio. La rugosidad optima y el tipo de particulas abrasivas del granallado para una respuesta optima in vitro e in vivo fue previamente determinada en nuestro laboratorio. Sin embargo, todavia estan por determinar cuales son las causas ultimas que llevan al biomaterial a su exitosa respuesta biologica. En este trabajo se han estudiado superficies pulidas y rugosas de Ti c.p. obtenidas mediante el granallado con particulas abrasivas de diferente composicion quimica(Al2O3 y SiC) y diferentes tamanos (212-300μm; 425-600μm; 1000-1400μm). La completa caracterizacion de las propiedades fisica y quimica de la superficie, incluyendo la rugosidad, la composicion quimica, la mojabilidad/energia libre y la carga electrica de las superficies ensayadas ha llevado a una serie de relevantes conclusiones. Entre ellas, cabe destacar que a) la composicion quimica de las particulas de granallado, asi como el metodo de esterilizacion fueron los principales factores que influyeron en la mojabilidad y la energia libre superficial de las superficies de titanio estudiadas, b) el metodo de esterilizacion cambio en la energia superficial el caracter de donante de electrones de las superficies mediante el cambio de la cantidad y la naturaleza de las sustancias adsorbidas, y c) la composicion quimica de las particulas de granallado no influyo en la carga electrica a pH fisiologico ni en el punto isoelectrico de las superficies. Un segundo paso consistio en el uso de una microbalanza de cristal de cuarzo con monitorizacion de la energia de disipacion, para el estudio de la cinetica de adsorcion (cantidad y conformacion) y de los procesos de adsorcion competitiva de tres proteinas de especial interes en los procesos de curacion del hueso - la albumina de suero bovino (BSA), el fibrinogeno (Fbg), y la fibronectina (Fn)- en sensores lisos recubiertos de TiO2. Se determinaron diferentes modelos de procesos de adsorcion con una, dos o multiples pasos distinguibles en funcion de las proteinas en solucion. La capa adsorbida de BSA mostro los cambios mas significativos en sus propiedades mecanicas, de conformacion y de incorporacion de agua hasta que se alcanzaron las condiciones estables de adsorcion de proteinas. La BSA, la mas pequena de las proteinas ensayadas, desplazo la Fn y el Fbg cuando se ensayo en condiciones de la competencia por la adsorcion, indicando su mayor afinidad por las superficies de TiO2. Tambien se emplearon tecnicas de marcaje fluorescente para el estudio de la adsorcion proteica en superficies rugosas granalladas. En este estudio, por un parte, se pudo determinar que la cantidad de Fn y BSA adsorbidas en las superficies granalladas esta directamente correlacionada con su energia superficial. Por otra parte, se visualizo la adsorcion de fibronectina en solucion sobre muestras granalladas rugosas de Ti. La Fn formo un patron irregular de adsorcion con una mayor cantidad de proteina adsorbida en los picos que en los valles de la topografia. Tambien se evaluo la organizacion espacial de la matriz extracelular de los osteoblastos, ECM, sobre superficies de Ti lisas y rugosas por medio de la visualizacion de las fibrillas de Fn tenidas con marcador fluorescente. Las celulas osteoblasticas depositaron las fibrillas de Fn con un determinado patron organizado dentro de la matriz total secretada. Aparecen como una pelicula que cubre la parte superior de las diferentes superficies rugosas de titanio. Un resultado relevante es que el espesor de esta capa aumento con la rugosidad de la topografia subyacente. Sin embargo no mas de la mitad de la maxima distancia pico-valle se cubrio con la proteina secretada y/o reorganizada. Por ultimo, teniendo en cuenta las diferencias en la organizacion de la ECM y la adsorcion de Fn en las superficies ensayadas de Ti, se realizo un estudio de qRT-PCR para determinar la influencia de las propiedades superficiales del titanio, con y sin preadsorcion de Fn, en la respuesta osteoblastica. La expresion genica de la subunidad 5 de la integrina celular, como marcador de la adhesion celular, se incremento en las superficies granalladas con SiC en comparacion con las granalladas con alumina. Este resultado fue correlacionado con la mayor cantidad de Fn adsorbida debido a la mayor energia superficial de las superficies granalladas con SiC. El aumento de la rugosidad, asi como la presencia de particulas de alumina en las superficies rugosas incremento la actividad de ALP y la expresion genica de ALP mRNA por los osteoblastos, y por lo tanto su diferenciacion.