Izbitje genske gruče SNORD116 iz Prader-Willi lokusa v sesalskih celičnih linijah

Prader-Willijev sindrom (PWS) je kompleksna multisistemska genetska bolezen, ki povzroca nevroloske, metabolne, endokrine in vedenjske motnje. Bolezen je posledica pomanjkanja izražanja ocetovsko podedovanih genov na 15q11.2-q13 genomski regiji. Stevilne studije z mikrodelecijami so zožile kriticno regijo PWS na gruco genov SNORD116, ki predstavlja glavno genetsko determinanto bolezni. Gensko gruco SNORD116 sestavlja 29 homologov, ki spadajo v družino malih nukleolarnih RNA s C/D ohranjenim motivom. Sekvenca SNORD116 ni komplementarna nobeni od kanonicnih RNA-tarc, zato ostaja bioloska funkcija teh nekodirajocih RNA se neznana. Ravno iz tega razloga je ena izmed najpomembnejsih nalog raziskav na tem podrocju iskanje in ovrednotenje nekanonicnih RNA-tarc iz družine SNORD116, ki bi bistveno pripomogle k dolocitvi vloge genske gruce pri patofiziologiji bolezni. V diplomskem delu smo s tehnologijo scCRISPR poskusali ustvariti celicni liniji NTERA2/D1 in SH-SY5Y z izbitima genskima grucama SNORD116. Celicna modela bi služila kot osnova za nadaljnje raziskovanje in validiranje najbolj verjetnih potencialnih tarc družine SNORD116. S pomocjo spletnih orodij smo na lokusu PWS izbrali tarcna zaporedja in nacrtali sgRNA, ki smo jih nato s PCR amplificirali ter podaljsali, da smo dobili ustrezne komponente za sistem scCRISPR. Po tem, ko smo pripravili vse komponente in preverili njihovo ustreznost, smo z razlicnimi metodami optimizirali ucinkovitost transfekcije pri obeh celicnih linijah. Plazmida in konstrukta sgRNA smo nato z nacinom, ki se je izkazal za najbolj ucinkovitega, vnesli v celice in preverjali, ce so komponente sistema scCRISPR povzrocile izbitje genske gruce SNORD116 v celicnem okolju. Za preverjanje smo uporabljali posamezne izolirane klone, pri katerih smo s specificnimi zacetnimi oligonukleotidi analizirali spremembe na genomski DNA na lokusu PWS. Izbitje genske gruce SNORD116 ni bilo uspesno pri nobeni od izbranih celicnih linij, najverjetnejsi vzrok za negativen rezultat pa je prenizka ucinkovitost transfekcije. Kljub temu, da nismo uspeli izdelati željenih celicnih modelov, smo v diplomskem delu uspesno vzpostavili sistem in metode potrebne za spreminjanje genoma s sistemom CRISPR/Cas9. Poleg tega smo optimizirali metode za preverjanje vnosa mutacij in selekcioniranja ter generiranja posameznih klonov. Nase ugotovitve bodo služile kot osnova za nadaljnje poskuse izbitja vecjih genskih segmentov v celicnem okolju in s tem generiranjem modelov, ki nam bodo v prihodnje pomagali pri odkrivanju bioloske vloge te enigmaticne genske gruce.