Aspergillus fumigatus F-box protein Fbx15 functions are dependent on its nuclear localisation signals and are partially conserved between A. fumigatus and A. nidulans

Aspergillus fumigatus ist ein weltweit verbreiteter, filamentoser Pilz, der hautsachlich auf kompostierbarem Medium vorkommt. Als opportunistischer Krankheitserreger reprasentiert A. fumigatus die Hauptursache fur atemwegsinvasive Aspergillose in immungeschwachten Individuen. Pilzspezifische Entwicklungsprozesse und Virulenz bedurfen eines kontrollierten Gleichgewichts der Synthese, des Abbaus sowie der posttranslationalen Modifikation regulatorischer Proteine. Solche regulatorischen Proteine werden fur Entwicklungsprozesse, Signaltransduktionen und die DNA-Instandhaltung wahrend der Kolonisierung verschiedenster Habitate oder Wirten benotigt. F-box Proteine sind Teil des Skp1/A-F-box-Cullin (SCF) Ubiquitin RING Ligasekomplexes. Sie fungieren als Substratrezeptoren fur Proteine, die fur ihren Abbau am 26S Proteasom posttranslational ubiquitiniert werden. Das Aspergillus-spezifische F-box Protein Fbx15 wurde erstmals in A. nidulans als entwicklungsrelevantes Protein beschrieben. A. fumigatus Fbx15 ist entscheidend fur die Regulation des Sekundarmetabolismus, wobei die Biosynthese des Mykotoxins Gliotoxin reguliert wird. Zudem wird A. fumigatus Fbx15 fur die Stresstoleranz und Pathogenitat des Pilzes benotigt. A. fumigatus Fbx15 ist fur seinen Proteintyp untypisch, da bis jetzt keine Funktion bezuglich der Proteindegradation mittels Ubiquitinierung durch den SCFFbx15 -Komplex identifiziert wurde. Stattdessen wurde eine Fbx15-abhangige Kernlokalisierung der essentiellen Ko-Repressoruntereinheit SsnF festgestellt. A. fumigatus Fbx15 besitzt zwei potentielle nukleare Lokalisierungssignale (NLS) in seiner primaren Aminosauresequenz. Diese Arbeit hatte drei Themen: (i) Die Funktionen von Fbx15 und potentieller Interaktionspartner wurden in A. nidulans und A. fumigatus miteinander verglichen. (ii) Es wurde untersucht, ob die in Abhangigkeit von A. fumigatus Fbx15 entstehende Stressantwort und Virulenz im Zusammenhang mit seiner regulatorischen Wirkung auf die Gliotoxinbiosynthese oder andere Mykotoxine steht. (iii) Die molekulare Funktion der beiden NLSs von A. fumigatus Fbx15 wurde untersucht, sowie dessen Einfluss auf die Lokalisierung von SsnF. (i) Diese Arbeit hat gezeigt, dass es eine partielle Ubereinstimmung in den Funktionen der beiden Aspergillus Fbx15-Proteine gibt. Beide heterolog exprimierte Fbx15-Proteine komplementieren gegenseitig ihre jeweiligen Funktionen hinsichtlich des Sekundarmetabolismus, sowie der Fbx15-abhangigen asexuellen und sexuellen Entwicklung in A. nidulans. Im Gegensatz dazu ist A. nidulans Fbx15 nur partiell fur Stresstoleranz relevant, wohingegen A. fumigatus Fbx15 eine Hauptfunktion in Stresstoleranz vorweist. Die Untersuchung der moglichen Wechselwirkung von Fbx15 mit den Transkriptionsfaktoren OefC und SrbB, des potentiellen Transkriptionsfaktors FiAt, und FidA, der potentielle Teil einer F-ATPase, wies keinen eindeutigen Zusammenhang zu Fbx15 in Entwicklung, Stressantwort und/oder Pathogenitat auf. (ii) A. fumigatus Fbx15 ist nicht nur fur die Regulierung von Gliotoxin verantwortlich. Es wird ebenfalls fur die Regulation der Biosynthese des Mykotoxins Fumagillin wahrend des vegetativen Wachstums benotigt. Daruber hinaus sind die regulatorischen Eigenschaften von A. fumigatus Fbx15 in Bezug auf Gliotoxin nicht fur die von Fbx15 geleitete Stressantwort wahrend des Minimalwachstums und der Pathogenitat im Galleria mellonella-Model von Bedeutung. (iii) Beide NLS-Sequenzen von A. fumigatus Fbx15 werden unabhangig voneinander fur den Kerntransport von Fbx15 wahrend des vegetativen Wachstums benotigt. Dabei ist NLS1 ist fur sich alleine unempfindlich gegenuber Stress. NLS2 wird hingegen fur den Transport von Fbx15 von der Kernmatrix zur Kernperipherie bei oxidativem Stress benotigt. Auserdem wird NLS2 fur die erfolgreiche Lokalisierung von SsnF in der Kernmatrix in Abwesenheit von Stress benotigt, sowie den Transport von SsnF zur Kernperipherie bei Stress. In diesem Prozess fuhrt Prasenz von NLS1 ohne NLS2 zu einer kontinuierlichen Kernlokalisierung von SsnF. NLS2 ist hierbei ein Element fur die Stressantwort, das fur den Shift von Fbx15 und SsnF von der Kernmatrix zur Kernperipherie verantwortlich ist, um vermutlich die von SsnF verursachte Repression der Genregulation in der Zelle zu unterbinden. Die Phosphorylierung von Fbx15 reprasentiert dabei eine zusatzliche Lokalisierungskontrolle, die jedoch nicht bei vegetativen Wachstum entscheidend ist. Dephosphorylierung oder Phosphorylierung von Fbx15 benotigt keine intakte NLS1- oder NLS2-Sequenz. Dennoch ist die zellulare Lokalisierung von Fbx15 bei oxidativem Stress abhangig von der Phosphorylierung oder Dephosphorylierung an den Aminosauren S468|9. Das Hauptergebnis dieser Dissertation besteht in der Identifizierung von A. fumigatus Fbx15 NLS2 als Kontrollelement, um Fbx15 und SsnF simultan aus der Kernmatrix wahrend oxidativen Stresses zu transportieren, was zu einer Derepression von Genen fuhrt, die z.B. fur die Produktion von Mykotoxinen zustandig sind.