Caractérisation biochimique du complexe Smc5-6

Les membres de la famille SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), presents dans tous les domaines de la vie, sont impliques dans des processus allant de la cohesion des chromatides-sœurs jusqu’a la reparation de l’ADN. Chacun des membres de cette famille, composee de 6 membres (Smc1 a Smc6), s’associe avec un autre membre ainsi qu’a des sous-unites non-SMC pour former 3 complexes : cohesine, condensine et Smc5-6. L’implication du complexe Smc5-6 dans plusieurs aspects du maintien de l’integrite genomique est bien demontree. Neanmoins, une question fondamentale concernant ce complexe demeure encore sans reponse: comment peut-il etre implique dans autant d’aspects de la vie d’une cellule? Encore a ce jour, il est difficile de repondre a cette question en raison du manque d’information disponible au sujet des activites biochimiques de ce complexe. C’est pourquoi l’objectif de ce travail consiste en la caracterisation biochimique du complexe Smc5-6. La biochimie de cohesine et condensine suggere diverses possibilites en ce qui a trait aux activites biochimiques du complexe Smc5-6. La premiere etape de mon projet fut donc d’elaborer une procedure pour la purification de Smc5 et Smc6 apres surexpression en levure. Apres plusieurs experiences, il apparut clair que les deux proteines possedent une activite de liaison a l’ADN simple brin (ADNsb) ainsi qu’a l’ADN double brins (ADNdb) et que, meme si les proteines peuvent se lier aux deux types d’ADN, elles possedent une plus grande affinite pour l’ADNsb. De plus, ces experiences permirent de demontrer que l’interaction entre Smc5 ou Smc6 et l’ADNsb est tres stable, alors que l’interaction avec l’ADNdb ne l’est pas. Suite a l’obtention de ces resultats, la seconde etape fut la determination de la ou des partie(s) de Smc5 et Smc6 permettant la liaison a l’ADN. Pour repondre a cette question, une dissection moleculaire fut realisee, suivi d’une caracterisation des differents domaines constituants Smc5 et Smc6. De cette facon, il fut possible de demontrer qu’il existe deux sites de liaison a l’ADN sur Smc5 et Smc6 ; le premier site se trouvant dans le domaine «hinge» ainsi que dans la region adjacente du domaine «coiled-coil» et le second au niveau de la tete ATPase des deux proteines. Bien que les deux domaines puissent lier l’ADNsb, il fut demontre qu’une difference majeure existe au niveau de leur affinite pour ce type d’ADN. En effet, le domaine «hinge» possede une affinite plus forte pour l’ADNsb que la tete ATPase. De plus, cette derniere est incapable de lier l’ADNdb alors que le domaine «hinge» le peut. L’identification des sites de liaison a l’ADN sur Smc5 et Smc6 permettra de creer de nouveaux mutants possedant un defaut dans la liaison a l’ADN. Ainsi, l’etude du complexe Smc5-6 durant la reparation de l’ADN in vivo sera facilite.