Tripartite multidrug efflux pumps in the human pathogen Salmonella typhimurium

Der intrazellulare Krankheitserreger Salmonella infiziert sowohl menschliche als auch tierische Wirte und ist eine haufige Ursache von Lebensmittelinfektionen. Abhangig von der Subspezies kann er entweder eine Magen-Darm-Infektion oder eine systemische Erkrankung verursachen. Wahrend in leichten Fallen meist keine besondere Behandlung notwendig ist, werden schwerere Formen der Krankheit mit Antibiotika behandelt. Dabei ist die Evolution von multiresistenten Stammen ein wiederkehrendes klinisches Problem bei Salmonella wie auch bei anderen Gram-negativen Bakterien, etwa E. coli oder Pseudomonas aeruginosa. Die Multiresistenz betrifft nicht nur Antibiotika, sondern auch andere toxische Substanzen wie Detergentien und Desinfektionslosungen und ist oft verbunden mit einer erhohten Fahigkeit der Bakterien, diese Substanzen mit Hilfe von aktiven Membrantransportern zu exportieren. Diese sogenannten „multidrug efflux pumps“ reichen in Gram-negativen Bakterien oft durch beide Membranen und bestehen aus drei Komponenten in unterschiedlicher Kopienzahl: i) einem Transporter in der inneren Membran, der die Energie fur den Substrattransport liefert, ii) einem Kanal in der auseren Membran, und iii) einem periplasmatischen Adaptorprotein, welches als verbindendes Element zwischen den beiden dient. Basierend auf ihrer Funktionsweise werden diese Effluxpumpen eingeteilt in primare Pumpen, die ATP als primare Energiequelle verwenden, und sekundare Pumpen, die als Ionen/Substrat Antiporter wirken und die elektrochemische Potentialdifferenz an der inneren Membran ausnutzen. Die vorliegende Studie untersucht je ein Mitglied beider Klassen: Ausgewahlt wurden MacAB-TolC als der wichtigste Reprasentant der tripartiten Pumpen vom ABC-Typ sowie der Proton/Substrat Antiporter AcrAB-TolC, der die klinisch relevanteste und am besten untersuchte tripartite Effluxpumpe ist. Die detaillierte Struktur und der Assemblierungsmodus des MacAB-TolC Komplexes ist grosteils unbekannt, wahrend zur AcrAB-TolC Pumpe bereits einige strukturelle Studien durchgefuhrt wurden – allerdings keine davon mit dem nativen Proteinkomplex. Wahrend meiner experimentellen Arbeit konnte ich beide Effluxpumpen direkt im Ursprungsorganismus (S. enterica serovar Typhimurium) uberexprimieren, wodurch die Assemblierung unter nativen Bedingungen erfolgen kann. Ein etabliertes Protokoll ermoglichte die Isolierung aus Membranfraktionen und die Visualisierung von beinahe-nativen Effluxpumpen in „negative-stain“ Elektronenmikroskopie sowie im Falle von AcrAB-TolC auch in der Kryo-Elektronenmikroskopie. Fur die individuelle Expression der zwei Pumpen wurde ein Deletionsstamm generiert, in dem keine anderen wichtigen tripartiten Effluxpumpen stark exprimiert werden, die die verlassliche Identifikation und Zuordnung der sichtbaren Partikel storen konnten. Weiters wurde die periplasmatische Komponente von MacAB-TolC aufgereinigt und fur die Produktion polyklonaler Antikorper verwendet, und die Funktionalitat der Plasmid-exprimierten Pumpen wurde bestatigt. Wir hoffen, dass unsere Bemuhungen zu einem besseren strukturellen und mechanistischem Verstandnis der tripartiten Effluxpumpen fuhren und zur Entwicklung neuer Strategien zur Bekampfung multiresistenter Keime beitragen konnen