PMA-qPCR法检测冷冻基质中非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌

背景副溶血性弧菌为冰鲜产品及肉制品中常见的污染微生物，致病性强，危害严重，出入境运输及加工的肉食品常采取冷冻冷藏的处理手段来防止微生物污染及生长，以保持食物新鲜。而残留的部分副溶血性弧菌会进入活的非可培养状态(Viable but non-culturable state，VBNC)，从而构成潜在的风险隐患。 目的建立可用于冷冻食品中VBNC副溶血性弧菌的快速检测方法，并探讨其适用性。 方法将大西洋鲑鱼1:10匀浆，加入终浓度为6.6×10 5 CFU/mL的副溶血性弧菌，-20 ℃分别诱导10、20、30和50 d。建立实时荧光PCR技术(qPCR)方法，测定其特异性、灵敏度及稳定性。利用PMA-qPCR法对不同冷冻时期样品中的副溶血性弧菌进行检测，同时与qPCR、平板培养法进行比较。 结果建立的qPCR方法特异性好，与其他阴性参考株无交叉反应；灵敏度高，检测限为19.8 CFU/mL；重复性好， C q 值的变异系数(CV)均在1.5%以下；标准曲线为 y =-3.272 x +45.310，线性回归系数 R 2 为0.996，定量范围为1×10 2 –1×10 9 CFU/mL。在低温诱导10-50 d后，qPCR法的 C q 值在26.32-27.34之间，与诱导前相比几乎没有变化；叠氮溴化丙锭(PMA)-qPCR法的 C q 值则从诱导前的26.43逐步上升到38.84，呈现明显的上升趋势，表明死菌的数量在显著上升。经过比较及统计，PMA-qPCR检测的活菌数均高于平板培养法测出的数量，差异显著( P 结论PMA-qPCR特异性及灵敏度高，能有效抑制对死菌的扩增，同时能克服传统平板培养法对VBNC的漏检缺陷，可方便、快捷地用于冷冻食品中受损致病微生物，尤其是进入VBNC状态的细菌检测。