酸碱“一步法”荧光PCR快速检测乙型肝炎病毒核酸

目的建立酸碱＂一步法＂荧光PCR快速检测乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）核酸。方法对建立的酸碱＂一步法＂荧光PCR中的核酸释放剂组分及其浓度、释放时间,PCR缓冲液的组分、p H值及防污染体系进行优化。验证该方法的灵敏度及线性范围,与同类试剂盒进行比较,并应用于其他病原体的检测。结果最佳核酸释放剂为：0.4 mol/L KOH,0.3%十二烷基硫酸锂（lithium lauryl sulphate,LLS）,0.3%Triton X-100,0.02%Foam Ban和0.5%N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）;最佳PCR缓冲液组分如下：0.5 mol/L Tris-醋酸（p H 7.4）,1%甘油,2.5%海藻糖,1 mol/L KCl,0.5 mol/L Mg Cl2,10 mmol/L EDTA、0.2%BSA和0.01%NaN3。建立的方法的最低检测量达1×10^2copies/ml,在1×10^2-1×10^9 copies/ml范围内参考品浓度与Ct值呈良好线性关系,回归方程为：y=-3.36 x＋39.469 9,R2=0.999 9。该方法与同类试剂盒的检测结果差异无统计学意义（P〉0.05）,不能用于检测解脲脲原体。结论酸碱＂一步法＂荧光PCR可用于HBV核酸的快速检测,该方法操作简便、快速,抗污染及干扰能力强,具有较高的临床应用价值。