Untersuchung von Abwasserproben auf Gentoxizität. Ergebnisse eines Ringversuchs mit dem in vitro - Mikrokerntest im Rahmen der Standardisierung nach ISO

Ziel und Hintergrund Im Zuge der internationalen Standardisierung des in vitro-Mikrokerntests mit V79-Zellen fur die Untersuchung und Bewertung von Wasserproben auf Gentoxizitat (ISO/ DIS 21427-2) wurde unter Federfuhrung der Bundesanstalt fur Gewasserkunde (BfG) ein nationaler Ringversuch durchgefuhrt. Es beteiligten sich 10 Laboratorien aus der freien Wirtschaft, von Hochschulen und Behorden. Beim Mikrokerntest handelt es sich um die Testung auf eine spezielle Form von Chromosomenaberration. Um die Standardisierung des Verfahrens abschliesen zu konnen, mussten codierte Abwasserproben in Form eines Ringtests untersucht werden. Es sollten damit die Durchfuhrbarkeit des Verfahrens dokumentiert und Validitatsdaten erhoben werden.Material und Methoden Der Mikrokerntest wurde mit V79-Zellen, einer permanent wachsenden Zelllinie von Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters durchgefuhrt. Es wurden vier codierte Proben von einer kommunalen und einer industriellen Klaranlage mit und ohne metabolische Aktivierung durch S9-Mix untersucht. Zwei der Proben waren im Vorfeld mit den Klastogenen Cyclophosphamid und Mitomycin C in definierten Konzentrationen aufdotiert worden.Bewertungskriterium fur Gentoxizitat war die Verdunnungsstufe der Probe im Test bei der keine statistisch signifikante Erhohung der Mikrokernrate mehr auftrat (LID; 'Lowest Ineffective Dilution'). Kriterium fur Zytotoxizitat war der Survival-Index, also die prozentuale Wachstumsrate der Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Als zusatzliche qualitative Merkmale wurden der Mitoseindex und der Proliferationsindex der Zellen bestimmt.Ergebnisse Obwohl mehrere der teilnehmenden Labore zuvor wenig bis keinerlei praktische Erfahrung mit dem in vitro-Mikrokerntest nach dem ISO-Entwurf hatten, konnen die Resultate als sehr gut bezeichnet werden. Es kam zu maximal 20% ungultigen Ergebnissen. Die beiden nicht-gentoxischen Proben wurden zu 100% bzw. zu 90% als negativ erkannt. Die mit Mitomycin C dotierte Probe (Soll: positiv ohne S9-Mix) wurde von allen Laboren richtig bewertet. Bei der Cyclophosphamid-Probe (Soll: positiv mit S9-Mix) erkannten 80% der Labore die Probe korrekt als In der Nachauswertung wurde festgestellt, dass die beiden falsch-negativen Ergebnisse auf technischen, nicht aber auf methodischen Mangeln beruhten. Die Resultate schwankten bei allen Proben maximal um eine Verdunnungsstufe bezogen auf den medianen LID-Wert. Der Survival-Index zeigte sich als robustes Mas fur die Zytotoxizitatsabschatzung bei der Abwassertestung.Diskussion Die Detektion von Mikrokernen ist ein haufig verwendeter Parameter fur das Erkennen zytogenetischer Schaden. Der Mikrokerntest ist anders als beispielsweise die Einzelzell-Gelelektrophorese (Comet-Assay) kein Indikatortestverfahren sondern zeigt bereits Mutagenitat an, da irreparable DNA-Schaden analysiert werden. Treten Mikrokerne mit erhohter Frequenz auf, ist in nachfolgenden Zellgenerationen mit schweren genetischen Schaden zu rechnen. Im Hinblick auf einen vorbeugenden Umweltund Gesundheitsschutz bedeutet dies, dass das Untersuchungsgut (Ab) Wasserprobe keine signifikante Erhohung der Mikrokernrate hervorrufen sollte.Schlussfolgerungen und Ausblick Beim vorliegenden Ringversuch handelt es sich um den ersten Interlaboratoriums-Vergleich des Mikrokerntests mit Abwasserproben. Das Verfahren soll als eukaryontisches Pendant die bereits nach DIN und ISO standardisierten bakteriellen Verfahren umu-Test und Ames-Test komplementieren.Die erfolgreiche Durchfuhrung dieses Ringversuchs rechtfertigt die Uberfuhrung des ISO-Entwurfs ('Draft International Standard') in den 'Final Draft International Standard' (FDIS), die letzte Vorstufe zur internationalen Norm. Es steht damit ein valides eukaryontisches Testsystem fur die Wassertestung zur Verfugung.