Différenciation en neurones sensoriels de cellules souches extraites du tissu cutané

Introduction La culture de neurones sensoriels animaux est un modele in vitro couramment utilise pour l’etude de l’inflammation neurogene, de la douleur ou du prurit. Cependant, cela pose des problemes ethiques et d’extrapolation des resultats a l’homme. Depuis quelques annees, des travaux ont mis en evidence la possibilite de differencier des iPS (cellules souches pluripotentes induites) ou des ES (cellules souches embryonnaires) en cellules ayant des caracteristiques de neurones sensoriels. Dans la plupart de ces travaux, ces neurones sont obtenus en deux etapes principales. Dans un premier temps, des cellules ES ou des iPS sont differenciees en cellules exprimant des marqueurs de precurseurs neuronaux et de la crete neurale. Puis dans un second temps, l’induction de la voie Wnt et/ou BMP permet la differenciation terminale. Nous avons cherche a savoir s’il etait possible de differencier directement des cellules souches derivees de la crete neurale en neurones sensoriels. Materiel et methodes Pour cela, nous avons utilise les skin-derived precursors (SKP) qui sont des cellules souches derivees de la crete neurale, differentiables en neurones et extraites du tissu cutane. Nos travaux ont ete realises a partir de peau abdominale. Les SKP ont ete extraits par dissociation enzymatique et mecanique. Ces cellules ont ete cultivees et entretenues en neurospheres dans un milieu classique contenant du FGF2 et de l’EGF. Apres plusieurs semaines, les cellules ont ete cultivees en adherence pendant 1 a 2 passages puis placees en condition de differenciation. Afin d’induire la voie Wnt pour orienter une differenciation des SKP en neurones sensoriels, nous avons choisi le CHIR99201 qui active la voie Wnt par inhibition de la glycogene synthase kinase 3 beta. Pour l’induction de la voie BMP, nous avons ajoute au CHIR99201, le BMP4. Resultats Nous avons ainsi obtenu (1) une confirmation en PCR que nos cellules SKP exprimaient des marqueurs de cellules de la crete neurale et de precurseurs neuronaux (p75NTR, SOX9, AP2, PAX3) et que (2) apres differenciation, elles acqueraient un phenotype de neurone sensoriel. Une partie des cellules acquerait une morphologie neuronale et bipolaire. En qPCR, nous avons pu montrer une augmentation par 7 de l’expression de BRN3A (marqueur des neurones sensoriels) apres 20 jours d’exposition au CHIR99201 et 8 jours de BMP4 par rapport aux cellules non differenciees. Grâce a des immunomarquages, nous avons retrouve dans cette population, 100 % de cellules exprimant les neurofilaments (marqueur neuronal) et p75NTR, 78 % de cellules exprimant BRN3A et 75 % des cellules exprimant la peripherine (marqueur des neurones peripheriques) apres 20 jours dans les memes conditions. La presence du canal TRPV1 a pu etre mise en evidence en immunocytochimie et PCR. Conclusion Ainsi, nous avons reussi a differencier des cellules souches issues de la peau adulte en cellules ayant un phenotype de neurones sensoriels.