Nouveaux modèles d’étude de la Granulomatose Septique Chronique grâce aux cellules souches pluripotentes induites – Application au développement de la thérapie protéique

La Granulomatose Septique Chronique (CGD) est une maladie genetique rare de l’immunodeficience innee affectant les cellules phagocytaires (neutrophiles, macrophages). Elle est causee par des mutations dans les sous-unites du complexe NADPH oxydase forme du cytochrome b558 membranaire (NOX2 associe a p22phox) et de facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox et p40phox). La deficience de ce complexe enzymatique va conduire a l’absence de formation de formes reactives de l’oxygene (FRO) microbicides et donc a l’apparition d’infections graves et recurrentes tres tot dans l’enfance. La chimioprophylaxie a vie permet de proteger ces patients mais peut etre responsable d’effets indesirables. La seule therapie curative est la transplantation de moelle osseuse mais tous les patients ne peuvent en beneficier, et la therapie genique n’est pas encore envisageable. Il y a donc un manque reel de nouvelles therapies pour cette maladie. Cependant pour developper de nouveaux traitements, il faut disposer de modeles physiopathologiques pertinents. Or, les modeles existants sont imparfaits ou manquants. Le but de notre travail est donc de produire des modeles cellulaires et animaux de la CGD pour developper dans un second temps, une nouvelle approche therapeutique basee sur l’utilisation de proteoliposomes.Grâce a leurs proprietes de pluripotence et d’auto-renouvellement a l’infini, les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont un outil puissant pour la modelisation physiopathologique. Ainsi, a partir de fibroblastes de patients atteints de CGD reprogrammes en cellules iPS, nous avons mis au point un protocole efficace de differenciation hematopoietique in vitro en neutrophiles et macrophages. Nous avons montre que ces cellules phagocytaires sont matures et reproduisent parfaitement le phenotype deficient en FRO des patients CGD. Nous avons donc obtenu des modeles cellulaires pertinent modelisant trois formes genetiques de CGD, la CGD liee a l’X et deux formes autosomiques recessives, CGDAR22 et CGDAR47.Nous avons ensuite realise la preuve du concept de l’efficacite de proteoliposomes therapeutiques sur les macrophages modelises de la forme CGDX, la forme genetique la plus frequente (70 % des cas) due a l’absence du cytochrome b558 membranaire (NOX2/p22phox). Grâce a une collaboration avec la start-up Synthelis SAS, des liposomes contenant le cytochrome b558 au niveau de la membrane lipidique ont ete produits dans un systeme d’expression acellulaire base sur l’utilisation d’extraits d’Escherichia coli. Ces liposomes NOX2/p22phox sont capables de reconstituer une enzyme NADPH oxydase fonctionnelle in vitro et de delivrer le cytochrome b558 a la membrane plasmique des macrophages CGDX qui presentent alors une restauration de l’activite NADPH oxydase avec la production de FRO.Enfin, nous nous sommes proposes de generer des souris dites « humanisees » par transplantation de cellules souches hematopoietiques CD34+ capables de prise de greffe et de reconstitution hematopoietique dans des souris immunodeficientes. A partir de cellules iPS saines, nous avons reussi a produire des cellules hematopoietiques CD34+ possedant un potentiel hematopoietique in vitro. Cependant, malgre des resultats encourageants, aucune prise de greffe in vivo n’a pu etre reellement confirmee a ce jour.Pour conclure, nous avons donc montre au cours de ce projet, la production de modeles cellulaires de trois formes genetiques de CGD a partir de cellules iPS. Puis le modele de macrophages CGDX nous a permis de faire la preuve de l’efficacite d’une nouvelle therapie in vitro, une « enzymotherapie substitutive liposomale », qui pourrait a terme, offrir une alternative therapeutique pour le traitement des infections aigues pulmonaires des patients CGD refractaires aux traitements antibiotiques et antifongiques conventionnels.