Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa de hígado de lubina (dicentrarchus labrax l.): purificación estudios cinéticos y de regulación

HA SIDO AISLADA Y PURIFICADA HASTA HOMOGENEIDAD LA GLUCOSA 6-FOSFATO DESHIDROGENASA DE HIGADO DE LUBINA MEDIANTE PRECIPITACION FRACCIONADA CON SULFATO AMONICO Y CROMATROGRAFIAS EN COLUMNA DE SEPHACRYL S-300 DEAE-SEPHACEL Y 2'5'-ADP-AGAROSA. EL PESO MOLECULAR DE LA ENZIMA NATIVA HA RESULTADO SER DE 140.000 Y EL DE LAS SUBUNIDADES DE 68.000. EL PH DE MAXIMA ACTIVIDAD ES DE 7 6 IDENTICO AL VALOR DE PH AL QUE ESTA ENZIMA ES MAS ESTABLE. SE HA DEMOSTRADO QUE EL NADP ESTABILIZA A LA ENZIMA A PHS ALCALINOS Y ACIDOS. LA GLUCOSA 6-FOSFATO Y ESPECIALMENTE EL NADP PROTEGEN A LA ENZIMA DE LA DESNATURALIZACION TERMICA. LOS ESTUDIOS DE ACTIVIDAD EN FUNCION DE LA TEMPERATURA INDICAN QUE LA ENZIMA SE ENCUENTRA EN DOS FORMAS CONFORMACIONALES ACTIVAS Y CON DIFERENTE ENERGIA DE ACTIVACION. LOS ESTUDIOS CINETICOS HAN MOSTRADO QUE LA GLUCOSA 6-FOSFATO DESHIDROGENASA CATALIZA LA REACCION EN ESTADO ESTACIONARIO MEDIANTE UN MECANISMOORDENADO DE ADICION DE SUSTRATOS Y DE LIBERACION DE PRODUCTOS: EN PRIMER LUGAR SE UNE A LA ENZIMA LIBRE EL NADP Y A CONTINUACION LA GLUCOSA 6-FOSFATO PARA FORMAR EL COMPLEJO TERNARIO EL CUAL SUFRE UN CAMBIO CONFORMACIONAL QUE TRAS LA CATALISIS LIBERA EN PRIMER LUGAR LA 6-FOSFOGLUCONATO LACTONA Y A CONTINUACION ELNADPH CON EL CONSIGUIENTE RETORNO DE LA ENZIMA AL ESTADO CONFORMACIONAL PRIMARIO. EL FENOMENO DE ISOMERIZACION QUE SE PRODUCE ES FUNCION DE LA CONCENTRACION DE NADPH. LOS ESTUDIOS DE INACTIVACION POR TRIPSINA DE LA ENZIMA HAN MOSTRADO QUE EL NADP POSEE UN PAPEL ESTRUCTURAL EN ESTE SISTEMA ENZIMATICO PUES ES RESPONSABLE DE UN CAMBIO CONFORMACIONAL QUE PROTEGE A LA ENZIMA DE LA INACTIVACION TRIPTICA. EL LUGAR DE UNION QUE PRODUCE ESTE FENOMENO ES DIFERENTE DEL CENTRO CATALITICO SUGIRIENDOSE LA EXISTENCIA DE UN CENTRO ESTRUCTURAL PARA EL NADP EN LA GLUCOSA 6-FOSFATO DESHIDROGENASA. MEDIANTE PIRIDOXAL 5'-FOSFATO SE HA MOSTRADO LA EXISTENCIA DE UN RESIDUO DE LISINA EN EL CENTRO ACTIVO PARA EL NADP. EL NADH ATP PEP Y